Để đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm, thí nghiệm được thiết kế với 1 bể nuôi tôm (30 tôm), nồng độ bào tử B. aquimaris SH6 1 ×
108 CFU/g thức ăn, cách tạo thức ăn chứa bào tử B. aquimaris SH6 và các điều kiện nuôi tôm tương tự như trình bày ở Mục 2.2.2, 2.2.3 và mô hình Hình 2.4. Thu ruột tôm và tách chiết RNA tổng số phục vụ đánh giá tỷ lệ % nảy mầm ở những thời điểm ngay sau khi cho ăn với độ nhạy cao. Bào tử chỉ cho ăn 2-3 g thức ăn một lần trong ngày đầu tiên, sau đó, bể nuôi tôm được duy trì các điều kiện nuôi tôm trong 7 ngày để theo dõi được sự thay đổi mức độ nảy mầm của chính bào tử lưu trú trong ruột tôm. Tiến hành thu mẫu tại các thời điểm xác định để đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng sử dụng chỉ thị sinh học phân tử là gen
BaqA-SH6, gen mã hóa cho enzyme α-amylase là enzyme không biểu hiện ở giai đoạn bào tử của vi khuẩn, do vậy có khả năng đặc trưng cho sự nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6. Tuy nhiên, thông tin về gen mã hóa cho enzyme α-amylase trên đối tượng là B. aquimaris còn rất hạn chế. Đặc biệt, B. aquimaris SH6 là loài mới nên hoàn toàn không có thông tin về trình tự gen này. Do vậy, nghiên cứu này tiến hành xác định chính xác trình tự gen BaqA-SH6 để làm nguyên liệu xây dựng phản ứng Realtime- PCR đánh giá mức độ biểu hiện gen BaqA-SH6, cụ thể như sau:
2.2.5.1. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân đoạn gen α-amylase ở B. aquimaris SH6 (BaqA-SH6)
Dựa vào đoạn trình tự gen BaqA (mã hóa enzyme α-amylase) của B. aquimaris
MKSC 6.2 (Mã: JN797599.1) do Puspasari và cộng sự công bố năm 2013 [59], chúng tôi sử dụng các trình tự gen BaqA của Anoxybacillus và phần mềm SnapGene để xác định đoạn trình tự tương đồng nhất (Hình 2.6). Anoxybacillus spp. thuộc họ GH13 được biết đến là các chủng Bacillus sp. có nhiều sự tương đồng về hệ gen với B. aquimaris [14].
Hình 2.6: Trình tự tương đồng đoạn gen BaqA giữa chủng B. aquimaris MKSC 6.2 và một số chúng Anoxybacillus spp.
Trình tự tương đồng này là cơ sở để thiết kế cặp mồi suy biến nhân đoạn gen
BaqA ở B. aquimaris SH6 (do vẫn còn một số nucleotide không đặc hiệu ở hai đầu đoạn trình tự tương đồng). Để đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi suy biến, phản ứng PCR được sử dụng với các bước được thể hiện trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1: Điều kiện của PCR nhân đoạn gen BaqA
Các bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Biến tính ban đầu 95°C 10 phút 1 chu kỳ
Biến tính 95°C 30 giây
35 chu kỳ
Gắn mồi 60°C 30 giây
Kéo dài 72°C 30 giây
Kéo dài 72°C 5 phút 1 chu kỳ
Để xác định chính xác mồi BaqA đặc hiệu cho chủng B. aquimaris SH6 (BaqA- SH6), sản phẩm PCR từ chủng B. aquimaris SH6 được chèn vào vector nhân dòng p- TOP TA V2 (Enzynomics, Hàn Quốc) (Hình 2.7). Vector tái tổ hợp chứa đoạn gen
trường LB lỏng, sau đó cấy trải trên đĩa thạch LB chứa kháng sinh (ampicilin 50 ug/ml) có bổ sung cơ chất X-gal và IPTG để chọn lọc khuẩn lạc mang gen tái tổ hợp BaqA- SH6. Sau đó, các khuẩn lạc nghi ngờ mang gen tái tổ hợp được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi vector (mồi M13) và điện di gel electrophoresis. Sản phẩm PCR có kích thước 305 bp (bao gồm 110 bp gen BaqA-SH6 và 205 bp đoạn gen M13) được lựa chọn để tinh sạch bằng kit tinh sạch DNA ANAPURE PCR product purification (ANABIO R&D, Việt Nam) và giải trình tự với cặp mồi M13. Kết quả giải trình tự cho phép xác định chính xác trình tự đoạn gen BaqA-SH6 của B. aquimaris SH6.
Hình 2.7: Mô hình vector biến nạp pTOP TA V2 (3807 bp) [80]
Để đảm bảo hiệu suất và độ đặc hiệu của phản ứng Realtime-PCR, độ đặc hiệu của mồi BaqA-SH6 được kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi BaqA-SH6 và khuôn là DNA tách chiết từ một số nguồn khác nhau như: (i) tế bào sinh dưỡng B. aquimaris SH6; (ii) tế bào sinh dưỡng một số chủng B. subtillis như B. subtillis PY79, HU36 và một số chủng sinh sắc tố tách chiết từ ruột tôm như B. aquimaris SH1 và B. marisflavi SH8 (Mã: KF443806) [48]; (iii) ruột tôm ăn bào tử B. aquimaris SH6 và tôm không ăn bào tử B. aquimaris SH6. Sản phẩm PCR được điện di gel agarose để đánh giá kết quả.
2.2.5.2. Đánh giá hiệu suất nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột
tôm
Tôm được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm, cho ăn một lần (2-3 g) với thức ăn chứa bào tử B. aquimaris SH6 ở nồng độ 1 × 108 CFU/g thức ăn, sau đó duy trì điều kiện nuôi tôm trong suốt 7 ngày. Thu mẫu ruột tôm tại các thời điểm: 0 h, 3 h, 4 h, 6 h, 12 h, 24 h, 2 D, 4 D và 7 D; mỗi thời điểm thu 9 mẫu ruột tôm, tách RNA và ghép mỗi 3 mẫu ruột thành 1 mẫu để hạn chế sai số ngẫu nhiên giữa các mẫu ruột tôm, tổng số mẫu phân tích ở mỗi thời điểm là 03 mẫu.
Mẫu ruột tôm được nghiền trong ni-tơ lỏng để tách chiết RNA bằng Kit Rneasy Mini Kit (Quiagen, Đức). Nồng độ RNA tổng số được đo bằng máy đo quang phổ NanoDrop One (Thermo Scientific, USA). 100 ng RNA tổng số được dùng làm khuôn cho phản ứng Real-time PCR nhân bản đoạn gen BaqA-SH6. Phản ứng Real-time PCR Taqman probe sử dụng Master mix RT430 - TOPrealTM One-step RT qPCR Kit (Enzynomics, Hàn Quốc) sử dụng chu trình nhiệt được trình bày ở Bảng 2.2. Lượng DNA nhiễm trong quá trình tách RNA được đánh giá bằng việc thực hiện phản ứng Real-time PCR với chu kỳ PCR tương tự nhưng loại bỏ bước phiên mã ngược, sử dụng Master mix RT430.
Bảng 2.2: Chu trình phản ứng Real-time PCR, TaqMan probe
Các bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Phiên mã ngược 50°C 30 phút 1
Biến tính ban đầu 95°C 10 phút 45 chu kỳ,
10 chu kỳ đầu: không thu tín hiệu huỳnh quang
Biến tính 95°C 10 giây
Gắn mồi và kéo dài 60°C 30 giây
Để xác định hiệu suất nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm, toàn bộ ruột tôm sau khi ăn thức ăn chứa bào tử B. aquimaris SH6 (1 × 108 CFU/g thức
ăn) được giã nhuyễn, ngâm trong 1 ml LB lỏng (16 h) để tạo điều kiện cho tất cả bào tử trong ruột nảy mầm (tương đương 100% nảy mầm). Tiến hành ly tâm 7000 vòng/phút, 3 phút, thu sinh khối chứa tế bào B. aquimaris SH6 và tách chiết RNA tổng số bằng Rneasy Mini Kit (Quiagen, Đức). RNA tổng số được pha loãng và sử dụng làm mẫu chuẩn cho phản ứng Real-time PCR Taqman probe (gồm các mẫu RNA đại diện cho hiệu suất này mầm tương đương 100%, 50%, 20%, 10%, 1% và 0,1%). Dựa vào giá trị Ct của phản ứng Real-time PCR từ mẫu chuẩn với các độ pha loãng khácn hau và mẫu thực thu tại các thời điểm xác định có thể đánh giá tỷ lệ nảy mầm tương ứng trong ruột tôm ở các thời điểm bằng công thức 2-(Cta-Ct20) x 20%, trong đó, Cta là giá trị Ct trung bình của phản ứng Realtime PCR sử dụng khuôn là 03 mẫu RNA tại mỗi thời điểm (0 h, 3 h, 4 h, 6 h, 12 h, 24 h, 2 D, 4 D và 7 D) và Ct20 là giá trị Ct của phản ứng Realtime PCR sử dụng mẫu chuẩn pha loãng tương đương 20% bào tử B. aquimaris SH6 nảy mầm trong ruột tôm.