Bên cạnh tốc độ tăng trưởng của tôm, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng tăng cường tổng hợp astaxanthin cho tôm của bào tử sinh sắc tố B. aquimaris SH6 bằng cách xác định nồng độ astaxanthin và màu sắc ở tôm thuộc mỗi nhóm thí nghiệm. Sau 28 ngày nuôi, n = 5 tôm ở mỗi nhóm thí nghiệm được giải phẫu, loại bỏ lớp vỏ kitin, thu phần thịt tôm để tách chiết astaxanthin (xem phần Phương pháp). Như kết quả trình bày trong Hình 3.13, có thể thấy rằng nồng độ astaxanthin ở nhóm tôm "Carophyll" và "SH6 carotenoid" (lần lượt là 5,3 và 3,9 µg/g tôm) cao vượt trội so với nhóm “ĐC” (1,2 µg/g tôm), P < 0,05. Tuy không cao vượt trội như nhóm "Carophyll" và "SH6 carotenoid", nhưng nồng độ astaxanthin ở nhóm "SH6 spore" (1,9 µg/g tôm, P < 0,05) cũng cao hơn nhiều so với nhóm “ĐC”.
Hình 3.13 Nồng độ astaxanthin của tôm tại thời điểm 28 D. *P<0,05
Để củng cố kết luận về khả năng kích thích tổng hợp astaxanthin giữa bốn nhóm thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đo màu sắc của tôm khi luộc (n = 5). Kết quả đo màu sắc tôm khá tương đồng với nồng độ astaxanthin của tôm ở mỗi nhóm (Hình 3.14), tôm thuộc các nhóm "Carophyll" và "SH6 carotenoid" có màu đỏ cam đậm hơn hẳn (Điểm màu: 22-23), theo sau đó là tôm ở nhóm "SH6 spore" (Điểm màu: 21-22) và cuối cùng là nhóm “ĐC” (Điểm màu: 20).
Hình 3.14: Màu sắc của tôm sau khi luộc tại thời điểm 28 D
Kết hợp kết quả đo nồng độ astaxanthin và đánh giá màu sắc của tôm bằng thang màu Roche - SalmoFanTM, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:
(1) Mối tương quan giữa nồng độ astaxanthin và màu sắc của tôm giữa bốn nhóm nghiên cứu chứng minh rằng astaxanthin đóng một vai trò then chốt trong sự hình thành sắc tố đỏ vàng ở tôm. Đồng thời cũng là bằng chứng khẳng định rằng carotenoid sản sinh bởi bào tử B. aquimaris SH6 đã được hấp thụ và chuyển hóa thành astaxanthin ở tôm thẻ chân trắng một cách hiệu quả.
(2) Một tỷ lệ % nhất định của bào tử B. aquimaris SH6 có khả năng nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng và sinh tổng hợp carotenoid trong ruột tôm và carotenoid này được chuyển hoá thành công thành astaxanthin có tác dụng làm tăng màu đỏ của tôm.
(3) Mặc dù sử dụng với nồng độ thấp hơn 100 lần (5 µg/g thức ăn), nhưng SH6 carotenoid ở dạng dịch chiết được hấp thu và chuyển hoá thành công thành astaxanthin tương đương với astaxanthin tổng hợp trong Carophyll (0,5 mg/g thức ăn). Điều này
cho thấy rằng, carotenoid tự nhiên tách chiết trực tiếp từ tế bào SH6 được hấp thụ và chuyển hóa thành astaxanthin trong mô tôm hiệu quả cao hơn nhiều so với astaxanthin dạng tổng hợp. Tuy nhiên, sử dụng SH6 carotenoid sẽ phải đối mặt với vấn đề chi phí và kỹ thuật khi tách chiết và bảo quản. Hơn nữa, "Carophyll" và "SH6 carotenoid" cho hiệu quả kích thích tốc độ tăng trưởng của tôm thấp hơn so với "SH6 spore".
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Dựa và những kết quả đã thu được trong nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau đây:
1. Bào tử B. aquimaris SH6, sử dụng với nồng độ 5 × 106 CFU/g thức ăn, có khả năng lưu trú, tồn tại trong ruột tôm thẻ chân trắng và số lượng SH6 tăng lên theo thời gian, từ 4,1 × 104 CFU/g ruột tôm tại ngày 1 đến 5,33 × 105 CFU/g ruột tôm ở ngày thứ 28. Bên cạnh đó, sử dụng bào tử B. aquimaris SH6 cho thấy sự tăng lên đáng kể về số lượng và đa dạng hệ vi sinh vật đường ruột của tôm, bằng chứng là sự xuất hiện một số chủng vi sinh vật có lợi như B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, M. chocolatum, S. amazonensis,… ở nhóm tôm được cho ăn bào tử B. aquimaris SH6.
2. Bào tử B. aquimaris SH6 lần đầu tiên được chứng minh có khả năng nảy mầm trong ruột tôm ngay sau 4 h cho ăn với tỷ lệ 0,03% và đạt ngưỡng 27,87% tại thời điểm 24 h.
3. Bào tử B. aquimaris SH6 có tác dụng kích thích, tăng cường hệ miễn dịch tôm thẻ chân trắng, thể hiện qua sự tăng mức độ biểu hiện mRNA gen Rho lên 8,1 lần và hoạt tính enzyme PO tăng gấp 2 lần so với tôm không ăn bào tử.
4. Bào tử B. aquimaris SH6 (nồng độ 5 × 106 CFU/g thức ăn) được đánh giá là có tiềm năng đáng kể trong việc sử dụng làm chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn cho tôm giúp thúc đẩy quá trình tiêu hóa và hấp thụ thức ăn, giúp tôm tăng trưởng nhanh về trọng lượng (tăng lên 2 lần so với tôm không được ăn bào tử). Bên cạnh đó, bào tử B. aquimaris SH6 sinh carotenoid hứa hẹn khả năng giúp tôm tăng khả nang tổng hợp astaxanthin (nồng độ astaxanthin ở tôm ăn bào tử
B. aquimaris SH6 cao hơn gấp 2 lần so với tôm không được ăn bào tử) ở tôm, góp phần làm tăng giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của tôm.
Kiến nghị
1. Mở rộng nghiên cứu hoạt tính probiotic của bào tử B. aquimaris SH6 ở các nồng độ bào tử khác nhau và lựa chọn nồng độ tối ưu áp dụng trên quy mô thực địa để đánh giá hiệu quả sử dụng của probiotic dạng bào tử.
2. Nghiên cứu thêm về khả năng tái hình thành bào tử của B. aquimaris SH6 trong ruột tôm để đánh giá chu kỳ sống của chúng.
3. Phát triển sản phẩm thương mại dạng thức ăn nuôi tôm bổ sung bào tử B. aquimaris SH6.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Viện Kinh tế và Quy hoạch Thủy sản. (2015). BÁO CÁO - Thực hiện kế hoạch năm 2017, nhiệm vụ, giải pháp chủ yếu thực hiện kế hoạch năm 2018.
2. Huỳnh Hữu Điền, Phạm Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú (2015), Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn Bacillus đến sinh trưởng, tỷ lệ sống và các yếu tố môi trường trong bể nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 36, pp. 98-106.
3. Thái Bá Hồ, Ngô Trọng Lư (2006), Kỹ thuật nuôi tôm thẻ chân trắng, Nhà Xuất Bản Nông nghiệp Hà Nội.
4. Phạm Thị Tuyết Ngân, Trần Sương Ngọc (2014), Ảnh hưởng của Bacillus lên môi trường nuôi và tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 34, pp. 99-107.
5. Tạ Văn Phương, Nguyễn Văn Bá, Nguyễn Văn Hòa (2014), Nghiên cứu nuôi tôm thẻ chân trắng theo quy trình biofloc với mật độ và độ mặn khác nhau, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, pp. 44-53.
6. Bùi Quang Tề (2003), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh.
7. Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Đăng Phúc Hải, Bùi Văn Đạt, Võ Văn Nha (2009),
Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic trong tạo chế phẩm nuôi tôm sú, Tạp chí Khoa học & Công nghệ các trường Đại học kỹ thuật, số 74, trang 113-117.
Tài liệu tham khảo tiếng Anh
8. Arturo A., Maria R. M., Marria A. M. (2006), “Probiotics for animal nutrition in the Euroupean Union”, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 45, pp. 91- 95.
9. Alex R. H., Karen K. H., Jay E. G., Chung K. M., Barun K. D., Tania P., David S., Patricia P. W., Swati B. A., Rahsaan D., Charles H. H., Lawrence O. T., Richard T. O., Paul J. J. (2006), “Charaterization of Bacillus cereus isolated associated with fatal pneumonias strains are closely related to Bacillus anthracis
and harbor B. anthracis virulence genes”, Journal of Clinical Microbiology, 44(9), pp. 3352-3360.
10. Brun H. L., Frédéric V.. (2006), “Shrimp pigmentation with natural carotenoids”, Aquaculture Asia Pacific, 2, pp. 34-35.
11. Campa-Córdova A. I., Hernández-Saavedra N. Y., Ascencio F.. (2002), “Superoxide dismutase as moculator of immune function in American white shrimp (Litopenaeus vannamei)”, Comporative Biochemistry Physiology C: Toxicology Pharmacology, 133, pp. 557-565.
12. Casula G., Cutting S. M.. (2002), “Probiotic: Spore germination in the gastrointestinal tract”, Applied Environmental Microbiology, 68, pp. 2344-2352.
13. Cerenius L., Soderhall K.. (2004), “The prophenoloxidase-activating system in invertebrates”, Immunology Reviews, 198, pp. 116-126.
14. Chai K. P., Othman N. F. B., The A. H., Ho K. L., Chan K. G., Shamsir M. S., et al.. (2016), “Crystal structure of Anoxybacillus α-amylase provides insights into maltose binding of a new slycosyl hydrolase subclass”, Scientific Reports.
15. Chan X. H., Koumoutsi A., Scholz R., Schneider K., Vater J., Sussmuth R., Piel J., Borriss R.. (2009), “Genome analysis of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 reveals its potential for biocontrol of plant pathogens”, Journal of Biotechnology, 140, pp. 27-37.
16. Chiu C. H,m Guu Y. K., Liu C. H., Phan T. M., Cheng W.. (2007), “Immune response and the gen expression in the white shrimp, Litopenaeus vannamei, induces by Lactobacillus plantarum”, Fish & Shellfish Immunology, 23, pp. 346-377.
17. Chubb J. R., Wilkins A., Thomas G. M., Insall R. H.. (2000), “The dictyostelium Ras protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement”, Journal of Cell Science, 113, pp. 709-719.
18. Cutting S. M.. (2011), “Bacillus: Probiotics”, Food Microbiology, 28, pp. 214- 220.
19. Das A., Nakhro K., Chowdhury S., Kamilya D.. (2013), “Effect of potential probiotic Bacillus amyloliquefaciens FPTB16 systemic and cutaneous mucosal immune response and disease resistance of catla”, Fish & Shellfish Immunology, 35, pp. 1547-1553.
20. Diler I., Dilek K.. (2002), “Significance of pigmentation and use in aquaculture”, Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Science, 2, 97-99.
21. Donohue D. C., Salminen S.. (1996), “Safety of probiotic bacteria”, Assia Pacific Journal of Clinical and Nutrient, 5, pp. 25-28.
22. Edward J. B.. (2010), “Bacillus cereus, a volatile human pathogen”, Central Microbiology Reviews, 23(2), pp. 382-398.
23. Evelyne B.. (2000), “Shrimp immunity and disease control”, Aquaculture, 191, pp. 3-11.
24. Feavers I. M., Foulkes J., Setlow B., Sun D., Nicholson W., Setlow P., et al.. (1990), “The regulation of transcription of the gerA spore germination operon of
Bacillus subtilis”, Molecular Microbiology, 4, pp. 275-282.
25. Fridovich I.. (1995), “Superoxide radical and superoxide dismutases”, Annual Review of Biochemistry, 69, pp. 97-112.
26. Fuller R.. (1989), “A review: Probiotics in man and animals”, Journal of Applied Bacteriology, 66, pp. 365-378.
27. Jiravanichpaisal P., Lee B. L., Kenneth S.. (2006), “Call-medicated immunity in srthropods: Hematopoiesis, coagulation, melanization and opsonization”,
28. Han F., Zhang X.. (2007). “Characterization of a ras-related nuclear protein (Ran protein) up-regulated in shrimp antiviral immunity. Fish and Shellfish Immunology, 23, pp. 937-944
29. Hadi Z., José L. B., Che R. S., Mohd S. K., Kamaruzaman S., Aziz A., Naghmeh N. (2012) “Effects of Bacillus subtilis on the growth performance, digestive enzymes, immune gene expression and disease resistance of white shrimp, Litopenaeus vanaamei”, Fish & Shellfish Immunology, 33, pp. 683-689.
30. Hernández-López J., Gollas-Galván T., Vargas-Albores F.. (1996), “Activation of the prophenoloxidase system of the brown shrimp (Penaeus californiensis
Holmes)”, Comparative Biochemistry Physiol - C Pharmacology Toxicology and Endocrinology, 113, pp. 61-66.
31. Hong H. A., Duc L. H., Cutting S. M.. (2005), “The use of bacterial spore formers as probiotics”, FEMS Microbilogy Reviews, 29, pp.813-835.
32. Hong H. A., Hoang J. M., Khaneia R., Hiep L. V., Urdaci M. C., Cutting S. M.. (2008), “The safety of Bacillus subtilis and Bacillus indicus as food probiotics”,
Journal of Applied Microbiology, 105, pp. 510-520.
33. Huang J. M., Ragione R. M. L., Nunez A., Cutting S. M.. (2008), “Immunostimulatory activity of Bacillus spores”, FEMS Immunology and medical Microbiology, 53, pp. 195-203.
34. Khaneja R., Perez-Fons L., Fakhrt S., Baccigalupi L., Steiger S., To E., et al.. (2010), “Carotenoids found in Bacillus”, Journal of Applied Microbiology, 108, pp. 1889-1902.
35. Khanitta K., Tipparat H.. (2012), “Effect of Lactobacillus plantarum isolated from digestive tract of wild shrimp on growth and survival of white shrimp (Litopenaeus vannamei) challenged with Vibrio harveyi”, Fish and Shellfish Immunology, 32(1), pp. 170-177.
36. Kim J. S., Diebold B. A., Kim J. I., Kim J., Le J. Y., Park J. B.. (2004), “Rho is involves in superoxidase formation during phagocytosis of opsonizied zymosans”, Journal of Biological Chenistry, 279, pp. 21589-21597.
37. Larsen N., Thorsen L., Kpikpi E. N., Stuer-Lauridsen B., Cantor M. D., Nielsen B., Brockmann E., Derkx P. M. F., Jespersen L.. (2013), “Charaterization of
Bacillus spp. strains for use as probiotic additives in pig feed”.
38. Lee S. Y., Söderhäll K.. (2002), “Early events in crustacean innate immunity”,
Fish & Shellfish Immunology, 12(5), pp. 421-437.
39. Li E., Xu C., Wang X., Wang S., Zhao Q, Zhang M., et al.. (2018), “Gut Microbiota and its modulation for healthy farming of Pacific white shrimp,
Litopenaeus vannamei”, Reviews in Fisheries Science & Aquaculture, 8249, pp. 1-19.
40. Li K., Zheng T., Tian Y., Xi Feng., Yuan J., Zhang G., Hong H.. (2007), “Beneficial effecrs of Bacillus licheniformis on the intestinal microfora and immuniti of the white shrimps, Litopenaeus vannamei”, Biotechnology Letters, 29(4), pp. 525-530.
41. Linán-Cabello M. A., Paniagua-Michel J., Zenteno-Savín T.. (2003), “Carotenoids and retinal levels in captive and wild shrimp, Litopenaeus vannamei”, Aquaculture Nutrition, 9, pp. 383-389.
42. Liu H., Soderhall K., Jiravanichpaisal P.. (2009), “Antiviral immunity in crustaceans”, Fish & Shell Fish Immunology, 27(2), pp. 79-88.
43. Livak K. J., Schmittgen T. D.. (2001), “Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt”, Method, 25, pp. 402-408.
44. Lu Q. Y., Arteaga R., Zhang Q., Huerta S., Go V. L. W., Heber D.. (2005), “Inhibition of protase cancer cell growth by an avocado extract: role of lipid- soluble bioactive subtances”, Journal of Nutriental Biochemistry, 16, pp. 23-30.
45. Makai T., Kaneko S., Matsumoto M., Ohori H., Biziulevičius G., Kislukhina O., et al.. (2008), “Guide to performing relative quantitation of gene ezpression using real-time quantitative PCR”, Infection and Immunology, 3, pp. 553-546.
46. McCord J. M., Fridovich I.. (1969), “Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein)”, Journal of Biological Chemistry, 244, pp 6049-6055.
47. Moir A., Smith D. A.. (1990), “The genetic of bacterial spore germination in the gastrointestinal tract”, Annual Reviews of Microbiology, 44, p. 531-553.
48. Ngo H. T., Nguyen T. T. N., Nguyen Q. M., Tran A. V., Do H. T. V., Nguyen A. H., et al.. (2016), “Screening of pigmented Bacillus aquimaris SH6 from the intestinal tracts of shrimp to develop a novel feed supplement for shrimp”,
Journal off Applied Microbiology, 121, pp. 1357-1372.
49. Nicholson W. L.. (1990), “Sporulation, germination and outgrowth”, Molecular Biological Methods for Bacillus.
50. Nicholson W. L.. (2002), “Roles of Bacillus endospores in the environment”,
Celluler and Molecular Life Sciences, 59, pp. 410-416.
51. Nguyen A. T. V., Pham K. C., Pham H. T. T., Pham H. L., Nguyen A. H., Dang L. T., et al.. (2014), “Bacillus subtilis spores expressing the VP28 antigen: A potential oral treatment to protect Litopenaeus vannamei againt white spot syndrome”, FEMS Microbiology Letter, 358, pp. 202-208.
52. Nguyen A. T. V., Nguyen V. D., Tran M. T., Nguyen L. T., Nguyen A. H., Phan N. T.. (2015), “Isolation and characterization of Bacillus subtilis CH16 strain from chicken gastrointestinal tracts for use as a feed supplement to promote weight gain in broilers”, Letter of Applied Micrbiology, 60, pp. 580-588.
53. Nguyen T. K. M., Nguyen Q. U., Huynh H. A., Le D. H., Tran H. T., Claudia S. R., et al.. (2006), “The intestinal life cycle of Bacillus subtilis and close relatives”, Journal of Bacteriology, 188, pp. 2692-2700.
54. Ochoa-Solano J. L., Olmos-Soto J.. (2006), “The functional property of Bacillus
for shrimp feeds”, Food Microbiology, 23, pp. 519-525.
55. Paidhungat M., Ragkousi K., Setlow P.. (2001). “Genetic requirements for induction of germination of spores of Bacillus subtilis by Ca2+ - Dipicolinate”.
Journal of Bacteriology, 183(16), pp. 4886-4893.
56. Pan D., He N., Yang Z., Liu H., Xu X.. (2005), “Differential gene expression profile in hepatopancreas of WSSV-resistant shrimp (Penaeus japonicas) by suppression subtractive hybridization”. Developmental and Comparative Immunology, 29, pp. 103-112.
57. Pane L., Radin L., Franconi G., Carli A.. (1996), “The carotenoid pigments of a marine Bacillus firmus strain”, Europe PMC, 72(11-12), pp. 303-308.
58. Perez-Fons L., Steiger S., Khaneja R., Bramley P. M., Cutting S. M., Sanmann G., et al. (2011), “Identification and the developmental formation of carotenoid pigments in the yellow orange Bacillus spore-formers”, Biochimica et Biophysica Acta, 1811, pp. 177-185.
59. Puspasari F., Radjasa O. K., Noer A. S., Nurachaman Z., Syah Y. M., Van der Maarel M., et al.. (2013), “Raw starch-degrading α-amylase from Bacillus aquimaris MKSC 6.2: Isolation and expression of the gene, bioinformatics and biochemical charaterization of the recombinant enzyme”, Journal of Applied Microbiology, 114, pp. 108-120.
60. Peter S.. (2003), “Spore germination”, Current Opinition in Microbiology, 6(6), pp. 550-556.
61. Pham K. C., Tran H. T. T., Doan V. C., Le P. H., Nguye A. T. V., Nguyen H. A., et al.. (2016), “Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome by contimuous oral administration of a low concentration of Bacillus subtilis
spores expressing the VP28 antigen”, Letter of Applied Microbiology, 64(3), pp. 184-191.
62. Rhee K. J., Sethupathi P., Driks A., Lanning D. K., Knight K. L.. (2004), “Role