Phương pháp sắc ký ái lực là phương pháp phân tách và tinh sạch một phân tử đặc hiệu từ một nhóm các phân tử trong một hỗn hợp. Phương pháp này dựa trên mối tương tác sinh học đặc hiệu giữa hai phân tử ví dụ như giữa kháng nguyên và kháng thể, enzyme và cơ chất, hay chất cho và chất nhận. Những mối tương tác này được ứng dụng để tinh sạch một trong các phân tử tương tác, được gọi là phối tử ái lực (affinity ligand), trên một ma trận chất rắn ở pha tĩnh, còn các phân tử đích ở pha động.
Có rất nhiều biến thể trong quy trình tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực nhưng đều dựa trên ba bước cơ bản được mô tả cụ thể ở Hình 9. Đầu tiên, ủ mẫu (tế bào đã được ly giải, serum) trong môi trường đệm thích hợp để mẫu có thể bám vào phối tử ái lực trên cột (ligand). Sau đó, hỗn hợp được rửa bỏ các thành phần, các chất không đặc hiệu bằng dung dịch đệm mà vẫn duy trì được ái lực của phân tử đích và ligand. Cuối cùng, phân tử đích từ hỗn hợp với ligand được thu bằng dung dịch đệm làm thay đổi ái lực của phân tử đích và ligand.
Hình 9: Các bước tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực
Thông thường, các ligand được cố định và liên kết với các giá thể là chất rắn, bằng cách hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm chức (ví dụ như: cấu trúc bậc 1 của các nhóm amin, carboxylic axit, aldehyde…). Ví dụ như trường hợp protein dung hợp với đuôi glutathione S-transferase (GST) sẽ dựa vào ái lực giữa đuôi GST và chất khử glutathione. Hay là các protein dung hợp với như 6xHis, polyHis – là những đuôi có ái lực với kim loại hóa trị II như nickel hay cobalt. Một số đuôi dung hợp khác như HA, Myc, FLAG, SUMO hầu hết đều được gọi là đuôi epitope vì chúng đòi hỏi phải có kháng thể đặc hiệu. Phương pháp sắc ký ái lực được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm vì hệ thống sử dụng khá là đơn giản, và hiệu suất cao.