Để đánh giá hoạt tính của enzyme tinh sạch được, protein tái tổ hợp được đem thử trong các phản ứng PCR, và so sánh bằng độ đậm nhạt của băng DNA trên gel Agarose. Protein được kiểm tra hoạt tính, xác định tương đối đơn vị hoạt độ và tối ưu các đệm phù hợp cho phản ứng PCR.
− Xác định đơn vị hoạt độ của enzyme
Xác định đơn vị hoạt độ của DNA polymerase bằng cách so sánh độ đậm nhạt của băng DNA sản phẩm của lượng enzyme khác nhau [18, 22], so sánh KOD- His, KOD-GST và enzyme Phusion DNA polymerase của hãng Thermo scientific. Hoạt tính enzyme ban đầu được thử với phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen có kích thước nhỏ 260 bp và 400 bp, với dung dịch đệm 5X HF của hãng Thermo scientific để kiểm tra hoạt tính và xác định tương đối đơn vị của enzyme so sánh với Phusion DNA polymerase của hãng Thermo scientific. Phản ứng PCR có thời gian biến tính ban đầu là 2 phút ở 95 °C, gồm 35 chu kỳ với thời gian biến tính là 95°C trong 15 s, gắn mồi ở 55 °C trong 15s, và kéo dài ở 72°C trong 10s. 10µl hỗn hợp phản ứng PCR gồm 2 µl 5X HF buffer, 0.2 µl dNTPs 10 mM, 0.3 µl xuôi và ngược, 10 ng khuôn plasmid, DNA polymerase với các thể tích khác nhau từ 0.3 – 3 µl, và nước. Kết quả phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm EtBr và quan sát dưới tia UV để đánh giá hoạt tính enzyme.
− Thử hoạt tính enzyme với các loại đệm chạy PCR và các kích thước gen khác nhau
Hai loại enzyme KOD-His và KOD-GST được thử hoạt tính với các loại kích thước gen khác nhau. Các loại khuôn và mồi có kích thước 500 bp, 1100 bp và 2400 bp đều được chúng tôi tối ưu và lựa chọn nồng độ phù hợp. Dựa trên những nghiên cứu trước đây về thành phần và nồng độ các chất trong đệm PCR, chúng tôi lựa chọn thành phần đệm 10x buffer có nồng độ các chất là 10 mM Tris HCl, 1 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.01% Triton X100 và 0.1 mg/ml BSA, và các đệm lựa chọn các pH khác nhau 7.5, 8.0 và 8.8. Ngoài ra chúng tôi cũng so sánh với đệm 5X HF buffer của hãng Thermo scientific để làm đối chứng.
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Nhân dòng gen KOD
3.1.1.Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD
Trình tự gen mã hóa cho protein KOD được tối ưu mã bộ ba để biểu hiện trong vật chủ E. coli sử dụng phần mềm OptimumGene trên trang web GenScript. Kết quả phân tích trình tự nhận được ở Bảng 7, theo đó, trình tự DNA đã được tối ưu có chỉ số CAI 1.00 đạt giá trị lý tưởng. Hơn nữa hàm lượng GC là 49.55% và chỉ số CFD là 0% đều trong khoảng giá trị lý tưởng. Do đó chúng tôi đã lựa chọn và đặt tổng hợp trình tự này bởi phương pháp hóa học tại công ty sinh hóa Phù Sa. Trình tự gen KOD được tổng hợp và thiết kế vào vector nhân dòng pUC19 với nồng độ 184 ng/µl.
Bảng 6: Kết quả phân tích tối ưu mã bộ ba sử dụng GenScript
Kết quả phân tích tối ưu mã bộ ba
Giá trị thực Giá trị lý tưởng Điều kiện Chỉ số thích ứng codon (Codon adaptation Index – CAI)
1.00 0.8-1.0 •Chỉ số CAI là 1.0 được coi là lý tưởng
•Chỉ số CAI càng thấp thì khả năng biểu hiện gen càng kém
Hàm lượng GC 49.55% 30% - 70% •Phần trăm GC lý tưởng trong khoảng 30% đến 70%
Phân bố tần số codon
(Codon Frequency Distribution - CFD)
0% < 30% • Trình tự gen không được tối ưu mã bộ ba có thể làm giảm hiệu suất quá trình dịch mã
3.1.2.Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR
Đoạn DNA mã hóa cho protein KOD từ vector pUC19-KOD được nhân dòng bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Đoạn gen được nhân lên có kích thước 2341 bp, có vị trí cắt của hai enzyme cắt giới hạn BamHI và EcoRI ở hai đầu 5’ và 3’, đảm bảo cho gen sau khi được cắt và chèn vào vector pET-M sẽ giữ đúng
khung đọc. Tương tự đoạn gen được chèn vào vector pGEX-4T-1 cũng có vị trí cắt của hai enzyme BamHI và SalI ở hai đầu 5’ và 3’.
Phản ứng PCR được thực hiện với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giống như đã mô tả ở phần phương pháp. Sản phẩm PCR được điện di trê n gel agarose 1% và quan sát kết quả dưới máy soi gel. Kết quả điện di sản phẩm PCR được thể hiện trên Hình 12, trong đó, marker M là thang DNA chuẩn giúp xác định kích thước tương đối của các băng DNA trong mẫu cần phân tích. Trong các đường chạy mẫu phân tích KOD-pGEX và KOD-pETM đều xuất hiện một băng duy nhất có kích thước khoảng trên 2300 bp tương đương với kích thước lý thuyết của gen Kod. Điều này chỉ ra rằng, chúng tôi đã nhân thành công đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu KOD BamHI F và KOD EcoRI R, Kod BamHI F và KOD SalI R. Độ sáng của băng sản phẩm
được so sánh với thang chuẩn cho thấy nồng độ sản phẩm PCR cao, có thể sử dụng cho phản ứng cắt nối.
A B
Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen KOD từ vector pUC19-KOD
(A) Đường chạy KOD pETM: sản phẩm PCR nhân gen KOD chứa trình tự cắt BamHI và
EcoRI ở hai đầu 5’ và 3’, so sánh với thang chuẩn 1 kb của hãng intRon ở đường chạy M.
(B) Đường chạy KOD pGEX: sản phẩm PCR nhân gen KOD chứa trình tự cắt BamHI và
SalI ở hai đầu 5’ và 3’, so sánh với thang chuẩn DNA 1 kb ở đường chạy M..
3.1.3.Chèn đoạn gen mã hóa KOD vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1.
Sau khi có được sản phẩm PCR của gen mã hóa cho KOD DNA polymerase, chúng tôi tiến hành cắt, nối đoạn gen này vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3. Tế bào nhận
plasmid và gen đã nối được cấy trải trên đĩa thạch LB và chọn lọc bởi kháng sinh ampicillin 100 mg/ml. Khuẩn lạc mọc được là khuẩn có thể chứa vector đã được chèn gen. Kết quả biến nạp ở Hình 14 cho thấy có khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa môi trường có kháng sinh. Điều này chứng tỏ tế bào E. coli BL21 DE3 có khả năng đã mang vector tái tổ hợp mong muốn.
(A) KOD – pET-M (B) KOD – pGEX-4T-1
Hình 14: Kết quả biến nạp sản phẩm lai KOD-pET-M và KOD-pGEX-4T-1 vào tế bào
E. coli BL21 DE3.
(A) Đĩa thạch có amp được cấy tế bào E. coli BL21 được biến nạp sản phẩm nối của gen
KOD và vector pET-M, (B) Đĩa thạch có amp được cấy tế bào E. coli BL21 được biến nạp
sản phẩm nối của gen KOD và vector pGEX-4T-1.
Để xác định được chắc chắn vector pET-M đã mang gen KOD mong muốn, chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi T7 promoter và T7 terminator nhân từ 2 vùng biên của MCS trên vector để xác định đoạn gen đã được chèn vào vector. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose ở Hình 14-A cho thấy khuẩn lạc số 3 trong số ba khuẩn lạc đã chọn ở sản phẩm nối với vector pET-M có xuất hiện băng có kích thước khoảng 2600 bp tương đương với kích thước tính toán lý thuyết.
Tương tự với đĩa thạch của sản phẩm nối gen KOD với vector pGEX-4T-1 ở Hình 14-B, có khuẩn lạc số 5 trong số năm khuẩn lạc được lựa chọn có chứa băng DNA có kích thước khoảng 2400 bp tương đương với kích thước lý thuyết khi sử dụng cặp mồi pGEX 5’ và pGEX 3’ trên vector pGEX-4T-1.
A: BL21-pETM- KOD B: BL21-pGEX4T1- KOD Hình 15: Kết quả PCR khuẩn lạc
A: Sản phẩm PCR các khuẩn lạc 1, 2, 3 chọn từ đĩa thạch nuôi cấy tế bào E. coli chứa sản
phẩm chèn gen KOD vào vector pETM được ký hiệu KL1, KL2, KL3, so sánh với thang
chuẩn M1kb. B: sản phẩn PCR từ 5 khuẩn lạc từ đĩa từ thạch nuôi cấy tế bào E. coli chứa
sản phẩm chèn gen KOD vào vector pGEX-4T-1 được ký hiệu KL1 đến KL5, so sánh với thang chuẩn 1 kb (M).
Hai khuẩn lạc từ hai đĩa thạch cho sản phẩm PCR có kích thước mong muốn được lựa chọn và nuôi cấy trong môi trường LB lỏng để tách plasmid và PCR để gửi đi giải trình tự.
3.1.4.Kết quả tách chiết plasmid DNA
Khuẩn lạc chứa DNA đoạn chèn đúng kích thước được chọn lọc từ phản ứng PCR khuẩn lạc được chuyển sang nuôi cấy qua đêm trong LB lỏng và dùng để tách chiết plasmid sử dụng GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA plasmid thu được được điện di trên gel agarose 1% và cho kết quả băng sáng rõ trên Hình 16. Nồng độ plasmid được đo ở bước sóng A260 là 150 ng/µl và 138 ng/µl lần lượt với plasmid pETM-KOD và pGEX- 4T-1-KOD.
Hình 16: Kết quả điện di plasmid
A – Sản phẩm điện di plasmid pETM-KOD, B – Sản phẩm điện di plasmid pGEX-4T-1 KOD
3.1.5.Giải trình tự plasmid
Plasmid tách chiết được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR để giải trình tự. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5% cho kết quả có một băng sáng (Hình 17) và đủ tiêu chuẩn để gửi đi đọc trình tự ở công ty 1st BASE (Malaysia) theo phương pháp Sanger. Trình tự của KOD được giải bằng cặp mồi T7 promoter và T7 terminator; Kod-F và Kod-R để xác định đoạn gen đã được chèn đúng khung đọc và xác định chính xác trình tự của toàn bộ đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase.
A B
Hình 17: Kết quả PCR kiểm tra plasmid
A: Kết quả PCR kiểm tra plasmid pETM-KOD từ hai vùng biên để giải trình tự, B: Kết quả PCR có khuôn là plasmid pGEX4T1-KOD
Trình tự gen thu được tiếp tục được dịch mã thành trình tự axit amin sử dụng công cụ SnapGene và được so sánh với trình tự axit amin của KOD gốc. Kết quả so sánh trình tự bằng công cụ tin sinh CLUSTALW được trình bày ở Hình 18. Kết quả so sánh trình tự chỉ ra rằng, trình tự gen mà chúng tôi chèn vào vector biểu hiện pET-M hay pGEX-4T-1 giống với trình tự gốc, chỉ khác ở trình tự giải được trên vector pET-M có chứa trình tự cắt thrombin và đuôi 6xHis, còn trên vector pGEX-4T-1 có chứa trình tự cắt thrombin. Như vậy kết quả chứng tỏ gen KOD đã được chèn vào vector biểu hiện không có đột biến và đã đúng khung đọc của vector.
Hình 18: So sánh trình tự axit amin của KOD với trình tự KOD gốc
Trình tự amino acid kí hiệu KOD (tương ứng cho KOD trên ngân hàng gen), pGEX4t1Kod: tương ứng với trình tự KOD trên vector pGEX-4T-1, pETMKod là trình tự axit amin trên vector pETM. Đuôi peptide chứa 6 histidine và trình tự cắt thrommbin (màu đỏ), và trình tự cắt gồm 6 acid amin của thrombin (đỏ). Dấu “*” thể hiện sự tương đồng giữa các acid amin của hai trình tự.
3.2.Biểu hiện protein tái tổ hợp
Gen mã hóa cho KOD DNA polymerase trên vector pET-M và pGEX-4T-1 được biến nạp và biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 (DE3). Chủng E. coli BL21 là chủng được thiết kế mang gen khử tính độc của promoter T7 sử dụng trong hệ thống vector biểu hiện pET, ngoài ra nó cũng được dùng để biểu hiện được với hệ thống promoter tac trong vector biểu hiện pGEX-4T-1. Tế bào chứa vector tái tổ hợp được biểu hiện trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0.3 mM trong 16 tiếng. Kết quả biểu hiện KOD DNA polymerase được phân tích bằng phương pháp điện di SDS-PAGE thể hiện trên Hình 19 và 20.
Kết quả biểu hiện protein KOD gắn đuôi Histidine (KOD-His) được thể hiện trên Hình 19. Ở đường chạy thứ 3, mẫu tế bào có cảm ứng bằng IPTG 0.3 mM (mẫu BL21-KOD-His + IPTG) đã xuất hiện băng đậm có kích thước gần 92 kDa.
Kích thước này tương ứng với kích thước của KOD DNA polymerase có gắn đuôi His. Trong khi đó, ở mẫu đối chứng (mẫu BL21-KOD-His không IPTG), không có băng protein có kích thước tương ứng này. Kết quả này chứng tỏ rằng, protein KOD-His đã được biểu hiện trong tế bào BL21 (DE3).
Hình 19: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi 6xHis ở tế bào BL21
Mẫu BL21-KOD-His +IPTG là mẫu cảm ứng biểu hiện bằng IPTG được so sánh với mẫu đối chứng là BL21-KOD-His không IPTG (mẫu không có chất cảm ứng IPTG.
Tương tự, Hình 20 thể hiện kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp KOD gắn đuôi GST. Ở giếng BL21-KOD-GST +IPTG, có một băng đặc trưng kích thước của protein KOD có gắn đuôi GST (KOD-GST) khoảng 116 kDa, kích thước này bao gồm protein KOD (90 kDa) và đuôi GST (26 kDa). Trong khi, ở giếng đối chứng thì không có băng này. Như vậy, protein KOD gắn đuôi GST đều được biểu hiện thành công ở nồng độ IPTG 0.3 mM và ở 37°C.
Hình 20: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi GST ở tế bào BL21
Mẫu BL21-KOD-GST +IPTG là mẫu cảm ứng biểu hiện bằng IPTG 0.3 mM được so sánh với mẫu đối chứng là BL21-KOD-GST không IPTG (mẫu không có chất cảm ứng IPTG).
3.3.Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực
3.3.1.Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel
− Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực nickel ở trạng thái tự nhiên
Sau khi biểu hiện thành công protein KOD có gắn đuôi Histidine, chúng tôi tiếp tục tiến hành tinh sạch protein này bằng phương pháp sắc ký ái lực, sử dụng cột có gắn ion nickel. Do được biểu hiện bằng hệ thống vector biểu hiện pET-M nên protein tạo ra có thêm 1 trình tự gồm 6 axit amin Histidin. Trình tự His-tag này giúp protein tái tổ hợp có thể bám với hạt nikel trên cột, còn các protein khác sẽ bị rửa trôi bởi dung dịch đệm rửa. Protein tinh sạch được phân tích trên gel SDS-PAGE 10% và được thể hiện trên Hình 21. Trên đường chạy cuối cùng, KOD-His là sản phẩm protein sau khi tinh sạch, có xuất hiện băng chính KOD, tuy nhiên vẫn còn rất nhiều băng protein tạp. Do đó, cần có các quy trình tối ưu quá trình tinh sạch protein KOD-His.
Hình 21: Kết quả tinh sạch protein KOD-His
M: thang chuẩn protein. Đường chạy KOD-His +IPTG là kết quả biểu hiện protein có chất cảm ứng IPTG được so sánh với mẫu không có IPTG ở đường chạy K IPTG. Đường chạy cuối cùng là protein KOD-His sau khi tinh sạch.
Do kết quả tinh sạch ở điều kiện thường không cho kết quả tốt, do đó, chúng tôi đã tối ưu quy trình tinh sạch protein KOD-His với nhiều phương pháp khác như dùng nhiệt độ để loại bỏ các băng tạp, hay tinh sạch ở điều kiện biến tính protein sử dụng Urea ở các nồng độ khác nhau.
− Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel kết hợp biến tinh bằng nhiệt
Dựa vào tính bền nhiệt của DNA polymerase và một số nghiên cứu tinh sạch các loại DNA polymerase khác đã áp dụng phương pháp dùng nhiệt để biến tính các protein khác [12, 18, 32]. Chúng tôi đã tiến hành ủ dịch tế bào sau phá vỡ ở nhiệt độ 75°C trong 15 phút để loại bỏ các protein tổng số, tuy nhiên kết quả ở hình 22 cho thấy, lượng protein tái tổ hợp tồn tại hầu hết ở pha cặn (mẫu Tủa sau ủ 75) so sánh với pha dịch sau khi ủ ở 75°C (Dịch pv sau ủ 75) thì băng protein KOD-His đã giảm đi đáng kể. Mẫu tinh sạch protein ở giếng cuối (Dịch tinh sạch) cũng không có băng protein KOD-His. Như vậy nhiệt độ có thể làm ảnh hưởng đến tính tan của KOD DNA polymerase, khi những protein bám vào polymerase bị phân hủy thì kéo theo KOD DNA polymerase cũng tồn tại ở pha cặn.