Sau khi có được sản phẩm PCR của gen mã hóa cho KOD DNA polymerase, chúng tôi tiến hành cắt, nối đoạn gen này vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3. Tế bào nhận
plasmid và gen đã nối được cấy trải trên đĩa thạch LB và chọn lọc bởi kháng sinh ampicillin 100 mg/ml. Khuẩn lạc mọc được là khuẩn có thể chứa vector đã được chèn gen. Kết quả biến nạp ở Hình 14 cho thấy có khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa môi trường có kháng sinh. Điều này chứng tỏ tế bào E. coli BL21 DE3 có khả năng đã mang vector tái tổ hợp mong muốn.
(A) KOD – pET-M (B) KOD – pGEX-4T-1
Hình 14: Kết quả biến nạp sản phẩm lai KOD-pET-M và KOD-pGEX-4T-1 vào tế bào
E. coli BL21 DE3.
(A) Đĩa thạch có amp được cấy tế bào E. coli BL21 được biến nạp sản phẩm nối của gen
KOD và vector pET-M, (B) Đĩa thạch có amp được cấy tế bào E. coli BL21 được biến nạp
sản phẩm nối của gen KOD và vector pGEX-4T-1.
Để xác định được chắc chắn vector pET-M đã mang gen KOD mong muốn, chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi T7 promoter và T7 terminator nhân từ 2 vùng biên của MCS trên vector để xác định đoạn gen đã được chèn vào vector. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose ở Hình 14-A cho thấy khuẩn lạc số 3 trong số ba khuẩn lạc đã chọn ở sản phẩm nối với vector pET-M có xuất hiện băng có kích thước khoảng 2600 bp tương đương với kích thước tính toán lý thuyết.
Tương tự với đĩa thạch của sản phẩm nối gen KOD với vector pGEX-4T-1 ở Hình 14-B, có khuẩn lạc số 5 trong số năm khuẩn lạc được lựa chọn có chứa băng DNA có kích thước khoảng 2400 bp tương đương với kích thước lý thuyết khi sử dụng cặp mồi pGEX 5’ và pGEX 3’ trên vector pGEX-4T-1.
A: BL21-pETM- KOD B: BL21-pGEX4T1- KOD Hình 15: Kết quả PCR khuẩn lạc
A: Sản phẩm PCR các khuẩn lạc 1, 2, 3 chọn từ đĩa thạch nuôi cấy tế bào E. coli chứa sản
phẩm chèn gen KOD vào vector pETM được ký hiệu KL1, KL2, KL3, so sánh với thang
chuẩn M1kb. B: sản phẩn PCR từ 5 khuẩn lạc từ đĩa từ thạch nuôi cấy tế bào E. coli chứa
sản phẩm chèn gen KOD vào vector pGEX-4T-1 được ký hiệu KL1 đến KL5, so sánh với thang chuẩn 1 kb (M).
Hai khuẩn lạc từ hai đĩa thạch cho sản phẩm PCR có kích thước mong muốn được lựa chọn và nuôi cấy trong môi trường LB lỏng để tách plasmid và PCR để gửi đi giải trình tự.
3.1.4.Kết quả tách chiết plasmid DNA
Khuẩn lạc chứa DNA đoạn chèn đúng kích thước được chọn lọc từ phản ứng PCR khuẩn lạc được chuyển sang nuôi cấy qua đêm trong LB lỏng và dùng để tách chiết plasmid sử dụng GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA plasmid thu được được điện di trên gel agarose 1% và cho kết quả băng sáng rõ trên Hình 16. Nồng độ plasmid được đo ở bước sóng A260 là 150 ng/µl và 138 ng/µl lần lượt với plasmid pETM-KOD và pGEX- 4T-1-KOD.
Hình 16: Kết quả điện di plasmid
A – Sản phẩm điện di plasmid pETM-KOD, B – Sản phẩm điện di plasmid pGEX-4T-1 KOD