Plasmid tách chiết được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR để giải trình tự. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5% cho kết quả có một băng sáng (Hình 17) và đủ tiêu chuẩn để gửi đi đọc trình tự ở công ty 1st BASE (Malaysia) theo phương pháp Sanger. Trình tự của KOD được giải bằng cặp mồi T7 promoter và T7 terminator; Kod-F và Kod-R để xác định đoạn gen đã được chèn đúng khung đọc và xác định chính xác trình tự của toàn bộ đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase.
A B
Hình 17: Kết quả PCR kiểm tra plasmid
A: Kết quả PCR kiểm tra plasmid pETM-KOD từ hai vùng biên để giải trình tự, B: Kết quả PCR có khuôn là plasmid pGEX4T1-KOD
Trình tự gen thu được tiếp tục được dịch mã thành trình tự axit amin sử dụng công cụ SnapGene và được so sánh với trình tự axit amin của KOD gốc. Kết quả so sánh trình tự bằng công cụ tin sinh CLUSTALW được trình bày ở Hình 18. Kết quả so sánh trình tự chỉ ra rằng, trình tự gen mà chúng tôi chèn vào vector biểu hiện pET-M hay pGEX-4T-1 giống với trình tự gốc, chỉ khác ở trình tự giải được trên vector pET-M có chứa trình tự cắt thrombin và đuôi 6xHis, còn trên vector pGEX-4T-1 có chứa trình tự cắt thrombin. Như vậy kết quả chứng tỏ gen KOD đã được chèn vào vector biểu hiện không có đột biến và đã đúng khung đọc của vector.
Hình 18: So sánh trình tự axit amin của KOD với trình tự KOD gốc
Trình tự amino acid kí hiệu KOD (tương ứng cho KOD trên ngân hàng gen), pGEX4t1Kod: tương ứng với trình tự KOD trên vector pGEX-4T-1, pETMKod là trình tự axit amin trên vector pETM. Đuôi peptide chứa 6 histidine và trình tự cắt thrommbin (màu đỏ), và trình tự cắt gồm 6 acid amin của thrombin (đỏ). Dấu “*” thể hiện sự tương đồng giữa các acid amin của hai trình tự.
3.2.Biểu hiện protein tái tổ hợp
Gen mã hóa cho KOD DNA polymerase trên vector pET-M và pGEX-4T-1 được biến nạp và biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 (DE3). Chủng E. coli BL21 là chủng được thiết kế mang gen khử tính độc của promoter T7 sử dụng trong hệ thống vector biểu hiện pET, ngoài ra nó cũng được dùng để biểu hiện được với hệ thống promoter tac trong vector biểu hiện pGEX-4T-1. Tế bào chứa vector tái tổ hợp được biểu hiện trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0.3 mM trong 16 tiếng. Kết quả biểu hiện KOD DNA polymerase được phân tích bằng phương pháp điện di SDS-PAGE thể hiện trên Hình 19 và 20.
Kết quả biểu hiện protein KOD gắn đuôi Histidine (KOD-His) được thể hiện trên Hình 19. Ở đường chạy thứ 3, mẫu tế bào có cảm ứng bằng IPTG 0.3 mM (mẫu BL21-KOD-His + IPTG) đã xuất hiện băng đậm có kích thước gần 92 kDa.
Kích thước này tương ứng với kích thước của KOD DNA polymerase có gắn đuôi His. Trong khi đó, ở mẫu đối chứng (mẫu BL21-KOD-His không IPTG), không có băng protein có kích thước tương ứng này. Kết quả này chứng tỏ rằng, protein KOD-His đã được biểu hiện trong tế bào BL21 (DE3).
Hình 19: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi 6xHis ở tế bào BL21
Mẫu BL21-KOD-His +IPTG là mẫu cảm ứng biểu hiện bằng IPTG được so sánh với mẫu đối chứng là BL21-KOD-His không IPTG (mẫu không có chất cảm ứng IPTG.
Tương tự, Hình 20 thể hiện kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp KOD gắn đuôi GST. Ở giếng BL21-KOD-GST +IPTG, có một băng đặc trưng kích thước của protein KOD có gắn đuôi GST (KOD-GST) khoảng 116 kDa, kích thước này bao gồm protein KOD (90 kDa) và đuôi GST (26 kDa). Trong khi, ở giếng đối chứng thì không có băng này. Như vậy, protein KOD gắn đuôi GST đều được biểu hiện thành công ở nồng độ IPTG 0.3 mM và ở 37°C.
Hình 20: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi GST ở tế bào BL21
Mẫu BL21-KOD-GST +IPTG là mẫu cảm ứng biểu hiện bằng IPTG 0.3 mM được so sánh với mẫu đối chứng là BL21-KOD-GST không IPTG (mẫu không có chất cảm ứng IPTG).
3.3.Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực