2.2.1.Sơ đồ nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được sơ đồ hóa các bước như Hình 12.
Hình 12: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Tổng hợp và nhân dòng gen KOD
− Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD
Trình tự axit amin của protein KOD từ vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 (gene bank: BAD84190.1) được lấy trên ngân hàng gen để tối
ưu mã bộ ba sử dụng phần mềm OptimumGene trên trang web GenScript. OptimumGene là phần mềm của công ty hàng đầu thế giới về dịch vụ tổng hợp gen. Các thuật toán mà OptimumGene đưa vào xem xét rất nhiều các yếu tố quan trọng liên quan đến giai đoạn khác nhau của biểu hiện protein, ví dụ như khả năng thích ứng codon, cấu trúc mRNA, yếu tố phiên mã và dịch mã. Các tham số được sử dụng trong phần mềm OptimumGene đó là chỉ số thích nghi codon (Codon Adaptation index – CAI), thành phần codon (codon context), Hàm lượng GC phân bố trong gen (GC content), cấu trúc bậc hai của mRNA và loại bỏ motif trong trình tự (Motif avoidance). Chỉ số CAI có giá trị dao động từ 0 đến 1. Giá trị CAI càng gần 1 thì
các gen có xu hướng sử dụng các codon phổ biến đối với hệ thống biểu hiện, giá trị CAI càng gần 0 thì các gen sử dụng các codon không hoặc ít được dùng trong hệ thống biểu hiện đó. Hàm lượng GC tốt nhất nên từ 30% - 70%, tỉ lệ GC càng cao thì lực liên kết giữa hai mạch sẽ lớn, gây khó khăn cho sự phá vỡ các liên kết trong việc tách mạch để PCR. Cấu trúc bậc hai của mRNA quyết định tính bền của phân tử, còn ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tham gia vào quá trình dịch mã tạo protein [1].
Trình tự gen nhận được từ phần mềm sẽ được kiểm tra lại vị trí cắt enzyme giới hạn, các chỉ số và được tổng hợp bằng phương pháp hóa học bởi công ty sinh hóa Phù Sa (PHUSA Biochem, Việt Nam).
− Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR
DNA đoạn chèn được khuếch đại bằng phản ứng PCR, sử dụng khuôn là vector pUC19-KOD. Mồi xuôi và ngược được sử dụng trong phản ứng PCR chứa vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn BamH I và EcoR I. 50µl hỗn hợp phản ứng gồm 1.5 µl plasmid pUC19-KOD (10 ng/µl), 1µl dNTPs 10 mM, 1.5 µl mồi xuôi và ngược, 5x Phusion HF buffer, 0.01 U Phusion DNA Polymerase (Thermo scientific). Phản ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ với thời gian biến tính 98°C 30s, thời gian gắn mồi là 15 giây ở 62°C và thời gian kéo dài 60 giây ở 72°C. Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose TAE 1% và tinh sạch sử dụng Gel Extraction Kit (Quiagen) dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.3.Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD
− Cắt, nối gen vào vector biểu hiện
DNA mã hóa cho protein KOD sau đó được chèn vào vector biểu hiện pETM (vector pET-32a đã được loại bỏ S-tag và Thioredoxin tag). DNA đoạn chèn và plasmid pETM đều được cắt bởi enzyme cắt giới hạn BamHI và EcoRI (Thermo
scientific). 10 µl sản phẩm PCR được cắt trong hỗn hợp gồm 4 µl 10x Fast Digest buffer, 1 µl BamHI, 1.5 µl EcoRI và thêm nước cho đủ thể tích 40 µl. Tương tự, 3
µl plasmid pETM cũng được cắt trong hỗn hợp gồm 4 µl 10x Fast Digest buffer, 1
µl BamHI, 1 µl EcoRI và thêm nước cho đủ thể tích 40 µl (Bảng 5). Hai hỗn hợp
theo tỉ lệ 1:1 và tinh sạch sử dụng bộ sử dụng Gel Extraction Kit (Quiagen) dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất.
Đối với gen được chèn vào vector pGEX-4T-1, DNA đoạn chèn và plasmid pGEX-4T-1 đều được cắt bởi enzyme cắt giới hạn BamHI và SalI (Thermo
scientific). Thể tích và thành phần của phản ứng cắt tương tự như đối với cắt gen vào vector pETM chỉ khác ở enzyme EcoRI được thay bằng SalI (Bảng 5).
Bảng 4: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn
Thành phần DNA Plasmid
H2O 23.5 µl 31 µl
10X Fast Digest buffer 4 µl 4 µl
BamHI 1 µl 1 µl
EcoRI/ SalI 1.5 µl 1 µl
Khuôn 10 µl 3 µl
Sản phẩm tinh sạch plasmid và DNA sau đó được ủ với enzyme nối T4 DNA ligase với thành phần gồm 16 µl sản phẩm tinh sạch plasmid và DNA đoạn chèn, 2 µl 10X T4 DNA ligase, 2 µl T4 DNA ligase (Bảng 6). Quá trình nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong một tiếng. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3.
Bảng 5: Thành phần phản ứng nối
Thành phần DNA
10X T4 DNA ligase 2µl
T4 DNA ligase 2 µl
Khuôn (DNA+plasmid) 16 µl
− Biến nạp sản phẩm nối DNA vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3
Tế bào khả biến E. coli BL21 được lấy ra từ -80 °C và ủ trên đá. 20 µl hỗn hợp phản ứng nối được thêm vào 100 µl tế bào khả biến và ủ trên đá 20 phút. Tế bào sau đó được sốc nhiệt ở 42 °C, 1 phút trước khi ủ 5 phút trên đá. Bổ sung 500 µl LB lỏng vào tế bào, ủ ở 37 °C trong 15 phút, sau đó được nuôi lắc ở 37 °C, và trong một tiếng. Tế bào được ly tâm 6000 rpm trong 2 phút và loại bỏ 500 µl dịch
nổi. Lượng tế bào còn lại được hòa tan và cấy trải trên đĩa thạch LB chứa 100 µg/ml kháng sinh amp để chọn lọc. Tế bào được nuôi cấy ở đĩa thạch trong 37 °C qua đêm.
− PCR sàng lọc khuẩn lạc
Phương pháp PCR sàng lọc khuẩn lạc được sử dụng để xác nhận DNA đã được chèn vào vector. Chọn một vài khuẩn lạc mọc riêng rẽ có kích thước trung bình và đánh dấu số thứ tự trên đĩa thạch. Sử dụng đầu tip lấy một nửa khuẩn lạc được đánh dấu và hòa tan tế bào này trong 50 µl nước cất đã khử trùng trong ống microcentrifuge, hỗn hợp này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR được tiến hành trong 10µl hỗn hợp chứa 2µl 5X HF buffer, 0.2 µl dNTPs 10 mM, 0.3 µl mồi T7 promoter và T7 terminator (Bảng 3) đối với vector pET-M và cặp mồi pGEX 3’ và 5’ đối với vector pGEX-4T-1, 0.002U Phusion DNA polymerase, 0.5 µl khuôn và nước. Phản ứng PCR được thực hiện trong 35 chu kỳ với thời gian biến tính 15s ở 98 °C, gắn mồi 10s ở 53 °C, kéo dài 1 phút ở 72 °C, mỗi chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5%.
− Phân lập plasmid DNA
Khuẩn lạc chứa DNA đoạn chèn đúng kích thước được chọn lọc từ phản ứng PCR khuẩn lạc được chuyển sang nuôi cấy qua đêm trong 10 ml LB lỏng chứa ampicillin 100 µg/ml, ở 37 °C, qua đêm. 5 ml dịch nuôi cấy qua đêm thu được ly tâm 13000 rpm, 2 phút để thu tế bào. Plasmid được tách chiết sử dụng GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA plasmid thu được trong 40 µl nước cất. Nồng độ plasmid được đo ở bước sóng A260 trên máy Nanodrop.
− Giải trình tự plasmid
Plasmid tách chiết được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR để giải trình tự. Khoảng 10 ng plasmid được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự trong hỗn hợp chứa 0.6 µl mồi T7 promoter, 0.6 µl mồi T7 terminator, 2 µl 5X HF buffer, 0.4 µl dNTPs 10mM, 0.002U Phusion DNA polymerase và nước cho đủ thể tích 20 µl. Phản ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ với thời gian biến tính 30s ở 98 °C, gắn mồi 10s ở 53 °C, kéo dài 1 phút ở 72 °C, mỗi chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5% và được gửi đi đọc trình tự sử dụng 2 cặp mồi
T7 promoter, T7 terminator và KOD-F , KOD-R (Bảng 4) ở công ty 1st BASE (Malaysia) theo phương pháp Sanger.
2.2.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp
− Biến nạp plasmid vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3
Vector biểu hiện chứa gen mã hóa KOD được biến nạp vào tế bào khả biến BL21 (DE3) để biểu hiện protein tái tổ hợp. Tế bào khả biến E. coli BL21 được lấy ra từ -80 °C và ủ trên đá. 0.5µl plasmid được thêm vào 100 µl tế bào khả biến và ủ trên đá 20 phút. Tế bào sau đó được sốc nhiệt ở 42 °C, 1 phút trước khi ủ 5 phút trên đá. Bổ sung 500 µl LB lỏng vào tế bào, ủ ở 37 °C trong 15 phút, sau đó được nuôi lắc ở 37 °C, một tiếng. Tế bào được ly tâm 6000 rpm trong 2 phút và loại bỏ 500 µl dịch nổi. Lượng tế bào còn lại được hòa tan và cấy trải trên đĩa thạch LB chứa 100 µg/ml kháng sinh amp để chọn lọc. Đĩa thạch được ủ 37 °C qua đêm.
− Biểu hiện protein tái tổ hợp
Chọn một khuẩn lạc chứa plasmid mong muốn từ đĩa thạch, nuôi cấy qua đêm trong 5ml LB lỏng chứa 100 µg/ml ampicillin. 1 ml dịch nuôi cấy qua đêm được chuyển sang 500 ml LB lỏng chứa 100 µg/ml ampicillin và được nuôi cấy ở 37°C. Khi mật độ tế bào ở bước sóng 600 nm (OD600) đạt 0.6, bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ cuối cùng là 0.3 mM. Protein tái tổ hợp được biểu hiện ở 37°C trong 16 tiếng. Tế bào được thu bằng ly tâm trong 15 phút, ở 4°C với tốc độ 4000 rpm. Dịch nổi được loại bỏ và cặn tế bào thu được bảo quản ở -20°C cho đến khi tinh sạch. Kết quả biểu hiện được điện di kiểm tra bằng phương pháp điện di protein SDS – PAGE.
2.2.5.Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực
− Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel với protein KOD-His
Để tối ưu quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp có độ tinh sạch tốt nhất, chúng tôi đã kết hợp phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực Nickel với nhưng điều kiện khác nhau. Cụ thể, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel ở dạng tự nhiên, biến tính bởi nhiệt và biến tính bằng Urea ở các nồng độ khác nhau.
− Tinh sạch protein gắn đuôi 6xHistidine bằng ái lực nickel ở dạng tự nhiên
Cặn tế bào thu được từ 500 ml môi trường nuôi cấy được hòa trong 25 ml dung dịch đệm nickel-binding (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl, 5mM Imidazole). Tế bào được phá vỡ bằng hệ thống siêu âm ở 4°C trong 1 giờ với thời gian 5 phút cho mỗi lần. Sau đó, dịch tế bào được ly tâm trong 30 phút, 13000 rpm ở 4°C để loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc Acrodisc®
Syringe 0.2 µm trước khi tra vào cột Econo-column (Biorad) đã được nạp sẵn Nickel và được ủ sẵn với nickel-binding buffer. Phần dịch nổi được đưa lên cột và ủ trên đá 10 phút. Sau đó, cột được rửa 10 lần với dung dịch washing (50 mM Tris- HCl pH 8.0, 0.3M NaCl, 30mM Imidazole). Protein được tách khỏi cột bằng dung dịch Elution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole). Sau khi tinh sạch, protein được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE.
− Tinh sạch protein gắn đuôi 6xHistidine bằng ái lực nickel kết hợp với sử dụng nhiệt
Phương pháp sử dụng nhiệt độ cao và ly tâm được sử dụng trong việc biến tính và loại bỏ các protein tổng số khi tinh sạch DNA polymerase đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu [7, 12, 38]. Dựa trên tính bền nhiệt của DNA polymerase, chúng tôi sử dụng nhiệt độ cao để biến tính các protein tổng số của vi khuẩn, kết hợp với ly tâm lạnh để loại bỏ các protein biến tính này. Dịch tế bào thu được sau bước siêu âm phá vỡ tế bào (như mô tả ở phần tinh sạch protein gắn đuôi His ở trạng thái tự nhiên) được ủ ở nhiệt độ 75°C và 85°C trong 15 phút, sau đó để trên đá 10 phút và ly tâm ở 13000 rpm, 4°C trong 30 phút. Phần dịch nổi sau ly tâm sẽ được thu và tinh sạch sử dụng phương pháp sắc ký với Nickel như mô tả ở phần tinh sạch ở trạng thái tự nhiên. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE.
− Tinh sạch protein gắn đuôi 6xHistidine dưới điều kiện biến tính
Cặn tế bào thu được từ 100 ml môi trường nuôi cấy được hòa trong 5 ml dung dịch đệm nickel-binding có bổ sung Urea với nồng độ lần lượt là 2 M, 4 M và 6 M (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazole, 2M/4M/6M Urea). Tế bào được phá vỡ bằng hệ thống siêu âm ở 4°C trong 1 giờ với thời gian 5 phút
cho mỗi lần. Sau đó, dịch tế bào được ly tâm trong 30 phút, 13000 rpm ở 4°C để loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc Acrodisc® Syringe 0.2 µm trước khi tra vào cột Econo-column (Biorad) đã được nạp sẵn Nickel và được ủ sẵn với nickel-binding buffer. Phần dịch nổi được đưa lên cột và ủ trên đá 10 phút. Sau đó, cột được rửa 10 lần với dung dịch washing có bổ sung Urea với các nồng độ tương ứng với nồng độ ở dung dịch binding lần lượt là 2M, 4M và 6M (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl, 30mM Imidazole, 2M/4M/6M Urea). Protein được tách khỏi cột bằng dung dịch Elution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole). Sau khi tinh sạch, protein được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE.
− Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST
Cặn tế bào thu được từ 500 ml môi trường nuôi cấy được hòa trong 25 ml dung dịch đệm PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 pH 7.4). Tế bào được phá vỡ bằng hệ thống siêu âm ở 4°C trong 1 giờ với thời gian 5 phút cho mỗi lần. Sau đó, dịch tế bào được ly tâm trong 30 phút, 13000 rpm ở 4°C để loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc Acrodisc®
Syringe 0.2 µm trước khi tra vào cột Econo-column (Biorad) đã được nạp sẵn Glutathione Sepharose 4B GST-tagged resin và cân bằng với đệm PBS. Phần dịch nổi được đưa lên cột và ủ trên đá 10 phút. Sau đó, cột được rửa 10 lần với dung dịch đệm PBS. Protein được tách khỏi cột bằng đệm Elution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10mM glutathione). Sau khi tinh sạch, protein được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE.
2.2.6.Thẩm tách protein
Protein sau khi được tinh sạch sẽ được thẩm tách trong 1 lít dung dịch đệm A (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl) trong 6 tiếng. Sau đó, protein được thẩm tách tiếp trong 1 lít dung dịch đệm B (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl) qua đêm. Cuối cùng protein được thẩm tách chuyển sang dung dịch đệm bảo quản (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Nonidet P-40, 0.5% Tween 20, 50% glycerol). Enzyme trong dung dịch bảo quản được để ở -20°C và sử dụng cho các phản ứng kiểm tra hoạt tính enzyme.
2.2.7.Thử hoạt tính enzyme
Để đánh giá hoạt tính của enzyme tinh sạch được, protein tái tổ hợp được đem thử trong các phản ứng PCR, và so sánh bằng độ đậm nhạt của băng DNA trên gel Agarose. Protein được kiểm tra hoạt tính, xác định tương đối đơn vị hoạt độ và tối ưu các đệm phù hợp cho phản ứng PCR.
− Xác định đơn vị hoạt độ của enzyme
Xác định đơn vị hoạt độ của DNA polymerase bằng cách so sánh độ đậm nhạt của băng DNA sản phẩm của lượng enzyme khác nhau [18, 22], so sánh KOD- His, KOD-GST và enzyme Phusion DNA polymerase của hãng Thermo scientific. Hoạt tính enzyme ban đầu được thử với phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen có kích thước nhỏ 260 bp và 400 bp, với dung dịch đệm 5X HF của hãng Thermo scientific để kiểm tra hoạt tính và xác định tương đối đơn vị của enzyme so sánh với Phusion DNA polymerase của hãng Thermo scientific. Phản ứng PCR có thời gian biến tính ban đầu là 2 phút ở 95 °C, gồm 35 chu kỳ với thời gian biến tính là 95°C trong 15 s, gắn mồi ở 55 °C trong 15s, và kéo dài ở 72°C trong 10s. 10µl hỗn hợp phản ứng PCR gồm 2 µl 5X HF buffer, 0.2 µl dNTPs 10 mM, 0.3 µl xuôi và ngược, 10 ng khuôn plasmid, DNA polymerase với các thể tích khác nhau từ 0.3 – 3 µl, và nước.