Sau khi biểu hiện thành công protein KOD gắn đuôi GST, chúng tôi tiến hành tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực với đuôi GST. Được biểu hiện bởi hệ thống biểu hiện vector pGEX nên protein biểu hiện được gắn đuôi GST có kích thước khoảng 26 kDa, do đó protein được tinh sạch nhờ ái lực của đuôi GST với cột glutathione. Kết quả tinh sạch protein được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 20, ở làn chạy dịch tinh sạch KOD-GST elute có một băng đậm kích thước tương đương với protein KOD-GST. Tuy nhiên vẫn còn xuất hiện một số băng protein tạp. So sánh với phương pháp tinh sạch protein KOD có gắn đuôi Histidine thì KOD có gắn đuôi GST có độ tinh sạch cao hơn, có thể do độ đặc hiệu của đuôi GST tốt hơn với đuôi Histidine.
Hình 25: Kết quả tinh sạch KOD-GST.
Protein KOD-GST được biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 và được cảm ứng bởi IPTG
(đường chạy KOD-GST có IPTG), so sánh với tế bào không bổ sung IPTG (đường chạy K IPTG), KOD-GST được tinh sạch ở đường chạy KOD-GST elute.
3.4. Thẩm tách protein
Protein sau khi được tinh sạch sẽ được thẩm tách trong 1 lít dung dịch đệm A (50mM Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl) trong 6 tiếng. Sau đó, protein được thẩm tách tiếp trong 1 lít dung dịch đệm B (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl) qua đêm. Cuối cùng protein được thẩm tách chuyển sang dung dịch đệm bảo quản (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Nonidet P- 40, 0.5% Tween 20, 50% glycerol). Enzyme trong dung dịch bảo quản được để ở - 20°C và sử dụng cho các phản ứng kiểm tra hoạt tính enzyme.
3.5.Thử hoạt tính enzyme
Xác định hoạt độ enzyme
Để xác định hoạt độ enzyme KOD-His và KOD-GST, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR để xác định lượng enzyme tối ưu cho một phản ứng PCR, so sánh với enzyme Phusion DNA polymerase của Thermo scientific 2U/µl. Thực hiện phản ứng PCR với lượng enzyme bổ sung cho mỗi phản ứng lần lượt là 0.3; 0.5; 1; 2 enzyme. Kết quả đối với enzyme KOD-His ở Hình 26 cho thấy sản phẩm của phản ứng PCR có bổ sung 0.5 µl hoặc 1 µl KOD-His đóng vai trò xúc tác đều có băng sáng nhất trong các nồng độ. Bằng mắt thường, so sánh tương đối độ đậm và độ sáng nét của sản phẩm PCR dùng 0.5 µl enzyme KOD-His với băng tạo thành bởi 0.2 µl enzyme thương mại Phusion 2U/µl (Thermo scientific), chúng tôi ước lượng hoạt độ của KOD-His sau khi tinh sạch khoảng 0.8U /µl, tương đương với khoảng 800-1000 đơn vị trên mỗi ml enzyme tinh sạch được.
Hình 26: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-His
Phản ứng PCR với khuôn có kích thước 400 bp sử dụng enzyme KOD-His với thể tích lần lượt 0.3; 0.5; 1; 2 µl, so sánh với 0.2 µl enzyme Phusion của hãng Thermo scientific
Tương tự với protein KOD-GST chúng tôi cũng tiến hành PCR xác định hoạt độ, so sánh với KOD-His và Phusion của Thermo scientific. Kết quả ở Hình 22 cho thấy, với cùng một lượng tế bào ban đầu sử dụng để tinh sạch, nhưng hoạt tính của enzyme thu được lại thấp hơn so với KOD-His. Khi sử dụng 0.5 – 1 µl enzyme KOD-GST thì không có băng nào xuất hiện, ở thể tích là 2 – 3 µl enzyme thì có băng sản phẩm mong muốn, tuy nhiên độ sáng vẫn mờ hơn so với enzyme KOD- His và Phusion DNA polymerase. Khi so sánh tương đối độ đậm và sắc nét của băng sản phẩm PCR bổ sung 3 µl enzyme KOD-GST xúc tác với 1 µl KOD-His và
0.2 µl Phusion, chúng tôi ước lượng hoạt độ enzyme KOD-GST tinh sạch được khoảng 0.1U/µl, tương đương 100 đơn vị enzyme trên mỗi ml enzyme tinh sạch được.
Hình 27: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-GST
Phản ứng PCR với khuôn có kích thước 260 bp sử dụng enzyme KOD-GST với thể tích lần lượt 0; 1; 2; 3; 4 µl, so sánh với 1 µl KOD-His và 0.2 µl enzyme Phusion của hãng Thermo scientific
Thử hoạt tính enzyme với các loại đệm chạy PCR và các kích thước gen khác nhau
Sau khi xác định được lượng enzyme tương đương với mỗi đơn vị enzyme thương mại, chúng tôi tiến hành pha chế dung dịch đệm cho phản ứng PCR dành riêng cho enzyme KOD tinh sạch được. Thành phần pha chế dung dịch đệm được pha dựa trên các nghiên cứu đã được công bố bao gồm 10 mM Tris HCl, 1 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.01% Triton X100 và 0.1 mg/ml BSA, và các giá trị các pH thử nghiệm khác nhau 7.5, 8.0 và 8.8, được so sánh với 5X HF buffer của hãng Thermo scientific. Cả 2 enzyme cũng được thử hoạt tính trên các gen có kích thước khác nhau từ 0.5 kp, 1.1 kp và 2.4 kp. Kết quả thể hiện trên Hình 28 ở hàng đầu tiên là kết quả đối với enzyme KOD-His và ở hàng thứ 2 là đối với enzyme KOD-GST. Đối với enzyme KOD-His, ở cách kích thước khác nhau và các buffer các khau thì các băng sản phẩm PCR đều lên sáng và có băng đặc hiệu, đối với buffer pH 7.5 và 8.8 thì sản phẩm vẫn có băng phụ mờ và mật độ băng chính cũng mờ hơn so với ở buffer pH 8.0 và HF buffer. Trái ngược lại thì hoạt tính của enzyme KOD-GST vẫn chưa ổn định.
Hình 28: Kết quả PCR thử hoạt tính enzyme KOD-His và KOD-GST với các kích thước gen và đệm PCR khác nhau.
Hàng trên – Kod-His: Phản ứng PCR sử dụng enzyme KOD-His với các đệm PCR có pH 7.5, 8.0, 8.8 tự pha và 5x buffer HF của hãng, ở mỗi loại đệm đều dung để nhân các khuôn có kích thước lần lượt 0.5; 1.1; 2.4 kb. Hàng dưới – Kod-GST: Phản ứng PCR sử dụng enzyme KOD-GST với các đệm PCR có pH 7.5, 8.0, 8.8 tự pha và 5x buffer HF của hãng, ở mỗi loại đệm đều dung để nhân các khuôn có kích thước lần lượt 0.5; 1.1; 2.4 kb.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Từ những kết quả đã đạt được, chúng tôi có những kết luận sau:
1. Chúng tôi đã tối ưu trình tự gen, nhân dòng gen mã hóa cho KOD DNA polymerase và chèn thành công vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1.
2. Biểu hiện protein KOD tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21. 4. Protein tái tổ hợp KOD-His được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực Nicken chưa có độ tinh sạch cao, còn protein KOD-GST đã tinh sạch được bằng phương pháp sắc ký ái lực với đuôi GST với độ tinh sạch cao.
5. Hoạt tính của enzyme KOD gắn đuôi His có hoạt tính tốt, còn enzyme KOD gắn đuôi GST kém hơn so với protein gắn đuôi His.
Kiến nghị
Trong phạm vi nghiên cứu của luận văn thạc sỹ này, tuy đã đạt được những kết quả nhất định song vẫn còn những hạn chế và độ tinh sạch của protein tái tổ hợp, gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Vì vậy, tôi có một số kiến nghị như sau:
1. Loại bỏ protein dung hợp GST khỏi protein KOD-GST bằng protease thrombin
2. Sử dụng sắc ký lọc gel sau đó để có thể loại bỏ các protein tạp khỏi protein KOD-His, cũng như đuôi GST khỏi hỗn hợp KOD-GST
3. Thiết kế các thí nghiệm thử độ bền và hoạt tính của DNA polymerase tái tổ hợp thu được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Dương Thị Kim Chi T. V. L., Lê Mậu Long (2016), "Xác định tham số quan trọng cho việc thiết kế gen dùng trong tái tổ hợp", Hội nghị Khoa học Quốc
gia lần thứ IX “Nghiên cứu cơ bản và ứng dụng Công nghệ thông tin (FAIR'9), pp.
Tiếng Anh
2. Barnes W. M. (1994), "PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates", Proc Natl Acad Sci U
S A, 91, pp. 2216-20.
3. Benson L. M., A. P. Null and D. C. Muddiman (2003), "Advantages of Thermococcus kodakaraenis (KOD) DNA Polymerase for PCR-mass spectrometry based analyses", J Am Soc Mass Spectrom, 14, pp. 601-4. 4. Block H., B. Maertens, A. Spriestersbach, N. Brinker, J. Kubicek, R. Fabis, J.
Labahn and F. Schafer (2009), "Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review", Methods Enzymol, 463, pp. 439-73.
5. Carson M., D. H. Johnson, H. McDonald, C. Brouillette and L. J. Delucas (2007), "His-tag impact on structure", Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 63, pp. 295-301.
6. Chou Q., M. Russell, D. E. Birch, J. Raymond and W. Bloch (1992), "Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy- number amplifications", Nucleic Acids Research, 20, pp. 1717-1723.
7. Dąbrowski S. and J. Kur (1998), "Cloning and Expression inEscherichia coliof the Recombinant His-Tagged DNA Polymerases fromPyrococcus furiosusandPyrococcus woesei", Protein expression and purification, 14, pp. 131-138.
8. Donahue Jr R. A. and R. L. Bebee (1999), "BL21-SI™ competent cells for protein expression in E. coli", Protein Expr. Purif, 7, pp. 289.
9. Drouin R., W. Dridi and O. Samassekou (2007), DNA Polymerases for PCR Applications,
10. Edwards M. C. and R. A. Gibbs (1994), "Multiplex PCR: advantages, development, and applications", Genome Research, 3, pp. S65-S75.
11. Elshawadfy A. M., B. J. Keith, E. Ooi, T. Kinsman, P. Heslop and B. A. Connolly (2014), "DNA polymerase hybrids derived from the family-B enzymes of Pyrococcus furiosus and Thermococcus kodakarensis: improving performance in the polymerase chain reaction", Frontiers in microbiology, 5, pp. 224.
12. Ghasemi A., A. H. Salmanian, N. Sadeghifard, A. A. Salarian and M. K. Gholi (2011), "Cloning, expression and purification of Pwo polymerase from Pyrococcus woesei", Iranian journal of microbiology, 3, pp. 118.
13. Hashimoto H., T. Matsumoto, M. Nishioka, T. Yuasa, S. Takeuchi, T. Inoue, S. Fujiwara, M. Takagi, T. Imanaka and Y. Kai (1999), "Crystallographic studies on a family B DNA polymerase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis strain KOD1", J Biochem, 125, pp. 983-6.
14. Hashimoto H., M. Nishioka, S. Fujiwara, M. Takagi, T. Imanaka, T. Inoue and Y. Kai (2001), "Crystal structure of DNA polymerase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1", J Mol Biol,
306, pp. 469-77.
15. Innis M. A., D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White (2012), PCR protocols: a guide to methods and applications, Place, Published.
16. Kaltenboeck B. and C. Wang (2005), "Advances in real-time PCR: application to clinical laboratory diagnostics", Advances in clinical chemistry, 40, pp. 219-259.
17. Li Y., S. Korolev and G. Waksman (1998), "Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation", The EMBO journal, 17, pp. 7514-7525.
18. Lu C. and H. P. Erickson (1997), "Expression inEscherichia coliof the Thermostable DNA Polymerase fromPyrococcus furiosus", Protein expression and purification, 11, pp. 179-184.
19. Magdeldin S. (2012), Affinity chromatography, Place, Published.
20. Mizuguchi H., M. Nakatsuji, S. Fujiwara, M. Takagi and T. Imanaka (1999), "Characterization and application to hot start PCR of neutralizing monoclonal antibodies against KOD DNA polymerase", J Biochem, 126, pp. 762-8.
21. Morikawa M., Y. Izawa, N. Rashid, T. Hoaki and T. Imanaka (1994), "Purification and characterization of a thermostable thiol protease from a newly isolated hyperthermophilic Pyrococcus sp", Appl Environ Microbiol,
60, pp. 4559-66.
22. Mroczkowski B. S., A. Huvar, W. Lernhardt, K. Misono, K. Nielson and B. Scott (1994), "Secretion of thermostable DNA polymerase using a novel baculovirus vector", Journal of Biological Chemistry, 269, pp. 13522-13528. 23. Papas T. S. and G. Vande Woude (1986), "Gene amplification and analysis", pp. 24. Pelley J. W. (2007), Elsevier's Integrated Biochemistry, Place, Published.
25. Pina A. S., I. L. Batalha and A. C. Roque (2014), "Affinity tags in protein purification and peptide enrichment: an overview", Methods Mol Biol, 1129, pp. 147-68.
26. Rosano G. L. and E. A. Ceccarelli (2014), "Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges", Frontiers in microbiology, 5, pp. 172-177.
27. Saiki R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis and H. A. Erlich (1988), "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase", Science, 239, pp. 487-91. 28. Saiki R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich and N.
Arnheim (1985), "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia",
Science, 230, pp. 1350-4.
29. Spriestersbach A., J. Kubicek, F. Schafer, H. Block and B. Maertens (2015), "Purification of His-Tagged Proteins", Methods Enzymol, 559, pp. 1-15. 30. Steitz T. A. (1999), "DNA polymerases: structural diversity and common
31. Takagi M., M. Nishioka, H. Kakihara, M. Kitabayashi, H. Inoue, B. Kawakami, M. Oka and T. Imanaka (1997), "Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR", Appl Environ Microbiol, 63, pp. 4504-10.
32. Takagi M., M. Nishioka, H. Kakihara, M. Kitabayashi, H. Inoue, B. Kawakami, M. Oka and T. Imanaka (1997), "Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR", Appl. Environ. Microbiol., 63, pp. 4504-4510.
33. van Pelt-Verkuil E., A. Van Belkum and J. P. Hays (2008), Principles and technical aspects of PCR amplification, Place, Published.
34. Vikis H. G. and K.-L. Guan (2004), Glutathione-S-transferase-fusion based assays for studying protein-protein interactions,
35. Waugh D. S. (2005), "Making the most of affinity tags", Trends in biotechnology, 23, pp. 316-320.
36. Wu S., W. A. Beard, L. G. Pedersen and S. H. Wilson (2013), "Structural comparison of DNA polymerase architecture suggests a nucleotide gateway to the polymerase active site", Chemical reviews, 114, pp. 2759-2774.
37. Yamashita M., J. Xu, D. Morokuma, K. Hirata, M. Hino, H. Mon, M. Takahashi, S. M. Hamdan, K. Sakashita, K. Iiyama, Y. Banno, T. Kusakabe and J. M. Lee (2017), "Characterization of Recombinant Thermococcus kodakaraensis (KOD) DNA Polymerases Produced Using Silkworm- Baculovirus Expression Vector System", Mol Biotechnol, 59, pp. 221-233. 38. Zheng W., Q. Wang and Q. Bi (2016), "Construction, Expression, and
Characterization of Recombinant Pfu DNA Polymerase in Escherichia coli",
The protein journal, 35, pp. 145-153.
39. Wang F., S. Li, H. Zhao, L. Bian, L. Chen, Z. Zhang, X. Zhong, L. Ma and X. Yu (2015), "Expression and Characterization of the RKOD DNA Polymerase in Pichia pastoris", PLoS One, 10, pp. 731-757.