− Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel với protein KOD-His
Để tối ưu quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp có độ tinh sạch tốt nhất, chúng tôi đã kết hợp phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực Nickel với nhưng điều kiện khác nhau. Cụ thể, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel ở dạng tự nhiên, biến tính bởi nhiệt và biến tính bằng Urea ở các nồng độ khác nhau.
− Tinh sạch protein gắn đuôi 6xHistidine bằng ái lực nickel ở dạng tự nhiên
Cặn tế bào thu được từ 500 ml môi trường nuôi cấy được hòa trong 25 ml dung dịch đệm nickel-binding (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl, 5mM Imidazole). Tế bào được phá vỡ bằng hệ thống siêu âm ở 4°C trong 1 giờ với thời gian 5 phút cho mỗi lần. Sau đó, dịch tế bào được ly tâm trong 30 phút, 13000 rpm ở 4°C để loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc Acrodisc®
Syringe 0.2 µm trước khi tra vào cột Econo-column (Biorad) đã được nạp sẵn Nickel và được ủ sẵn với nickel-binding buffer. Phần dịch nổi được đưa lên cột và ủ trên đá 10 phút. Sau đó, cột được rửa 10 lần với dung dịch washing (50 mM Tris- HCl pH 8.0, 0.3M NaCl, 30mM Imidazole). Protein được tách khỏi cột bằng dung dịch Elution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole). Sau khi tinh sạch, protein được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE.
− Tinh sạch protein gắn đuôi 6xHistidine bằng ái lực nickel kết hợp với sử dụng nhiệt
Phương pháp sử dụng nhiệt độ cao và ly tâm được sử dụng trong việc biến tính và loại bỏ các protein tổng số khi tinh sạch DNA polymerase đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu [7, 12, 38]. Dựa trên tính bền nhiệt của DNA polymerase, chúng tôi sử dụng nhiệt độ cao để biến tính các protein tổng số của vi khuẩn, kết hợp với ly tâm lạnh để loại bỏ các protein biến tính này. Dịch tế bào thu được sau bước siêu âm phá vỡ tế bào (như mô tả ở phần tinh sạch protein gắn đuôi His ở trạng thái tự nhiên) được ủ ở nhiệt độ 75°C và 85°C trong 15 phút, sau đó để trên đá 10 phút và ly tâm ở 13000 rpm, 4°C trong 30 phút. Phần dịch nổi sau ly tâm sẽ được thu và tinh sạch sử dụng phương pháp sắc ký với Nickel như mô tả ở phần tinh sạch ở trạng thái tự nhiên. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE.
− Tinh sạch protein gắn đuôi 6xHistidine dưới điều kiện biến tính
Cặn tế bào thu được từ 100 ml môi trường nuôi cấy được hòa trong 5 ml dung dịch đệm nickel-binding có bổ sung Urea với nồng độ lần lượt là 2 M, 4 M và 6 M (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazole, 2M/4M/6M Urea). Tế bào được phá vỡ bằng hệ thống siêu âm ở 4°C trong 1 giờ với thời gian 5 phút
cho mỗi lần. Sau đó, dịch tế bào được ly tâm trong 30 phút, 13000 rpm ở 4°C để loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc Acrodisc® Syringe 0.2 µm trước khi tra vào cột Econo-column (Biorad) đã được nạp sẵn Nickel và được ủ sẵn với nickel-binding buffer. Phần dịch nổi được đưa lên cột và ủ trên đá 10 phút. Sau đó, cột được rửa 10 lần với dung dịch washing có bổ sung Urea với các nồng độ tương ứng với nồng độ ở dung dịch binding lần lượt là 2M, 4M và 6M (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl, 30mM Imidazole, 2M/4M/6M Urea). Protein được tách khỏi cột bằng dung dịch Elution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole). Sau khi tinh sạch, protein được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE.
− Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST
Cặn tế bào thu được từ 500 ml môi trường nuôi cấy được hòa trong 25 ml dung dịch đệm PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 pH 7.4). Tế bào được phá vỡ bằng hệ thống siêu âm ở 4°C trong 1 giờ với thời gian 5 phút cho mỗi lần. Sau đó, dịch tế bào được ly tâm trong 30 phút, 13000 rpm ở 4°C để loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch nổi được lọc qua màng lọc Acrodisc®
Syringe 0.2 µm trước khi tra vào cột Econo-column (Biorad) đã được nạp sẵn Glutathione Sepharose 4B GST-tagged resin và cân bằng với đệm PBS. Phần dịch nổi được đưa lên cột và ủ trên đá 10 phút. Sau đó, cột được rửa 10 lần với dung dịch đệm PBS. Protein được tách khỏi cột bằng đệm Elution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 10mM glutathione). Sau khi tinh sạch, protein được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE.