− Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực nickel ở trạng thái tự nhiên
Sau khi biểu hiện thành công protein KOD có gắn đuôi Histidine, chúng tôi tiếp tục tiến hành tinh sạch protein này bằng phương pháp sắc ký ái lực, sử dụng cột có gắn ion nickel. Do được biểu hiện bằng hệ thống vector biểu hiện pET-M nên protein tạo ra có thêm 1 trình tự gồm 6 axit amin Histidin. Trình tự His-tag này giúp protein tái tổ hợp có thể bám với hạt nikel trên cột, còn các protein khác sẽ bị rửa trôi bởi dung dịch đệm rửa. Protein tinh sạch được phân tích trên gel SDS-PAGE 10% và được thể hiện trên Hình 21. Trên đường chạy cuối cùng, KOD-His là sản phẩm protein sau khi tinh sạch, có xuất hiện băng chính KOD, tuy nhiên vẫn còn rất nhiều băng protein tạp. Do đó, cần có các quy trình tối ưu quá trình tinh sạch protein KOD-His.
Hình 21: Kết quả tinh sạch protein KOD-His
M: thang chuẩn protein. Đường chạy KOD-His +IPTG là kết quả biểu hiện protein có chất cảm ứng IPTG được so sánh với mẫu không có IPTG ở đường chạy K IPTG. Đường chạy cuối cùng là protein KOD-His sau khi tinh sạch.
Do kết quả tinh sạch ở điều kiện thường không cho kết quả tốt, do đó, chúng tôi đã tối ưu quy trình tinh sạch protein KOD-His với nhiều phương pháp khác như dùng nhiệt độ để loại bỏ các băng tạp, hay tinh sạch ở điều kiện biến tính protein sử dụng Urea ở các nồng độ khác nhau.
− Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel kết hợp biến tinh bằng nhiệt
Dựa vào tính bền nhiệt của DNA polymerase và một số nghiên cứu tinh sạch các loại DNA polymerase khác đã áp dụng phương pháp dùng nhiệt để biến tính các protein khác [12, 18, 32]. Chúng tôi đã tiến hành ủ dịch tế bào sau phá vỡ ở nhiệt độ 75°C trong 15 phút để loại bỏ các protein tổng số, tuy nhiên kết quả ở hình 22 cho thấy, lượng protein tái tổ hợp tồn tại hầu hết ở pha cặn (mẫu Tủa sau ủ 75) so sánh với pha dịch sau khi ủ ở 75°C (Dịch pv sau ủ 75) thì băng protein KOD-His đã giảm đi đáng kể. Mẫu tinh sạch protein ở giếng cuối (Dịch tinh sạch) cũng không có băng protein KOD-His. Như vậy nhiệt độ có thể làm ảnh hưởng đến tính tan của KOD DNA polymerase, khi những protein bám vào polymerase bị phân hủy thì kéo theo KOD DNA polymerase cũng tồn tại ở pha cặn.
Hình 22: Kết quả tối tinh sạch KOD-His kết hợp với biến tính bằng nhiệt
M: thang chuẩn protein. Đường chạy KOD-His +IPTG là kết quả biểu hiện protein có chất cảm ứng IPTG được so sánh với mẫu không có IPTG ở đường chạy K IPTG. Đường chạy cuối cùng là protein KOD-His sau khi tinh sạch
− Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel ở điều kiện biến tính bằng Urea
Khi tinh sạch protein KOD-His ở điều kiện biến tính bằng Urea, chúng tôi đã lựa chọn các nồng độ Urea khác nhau 2M, 4M hay 6M. Hình 21-A là kết quả tinh sạch ở điều kiện biến tính với hệ đệm có bổ sung Urea 2M, protein KOD-His (KOD-His + IPTG) được biểu hiện so sánh với giếng K IPTG, không được thêm chất cảm ứng. Tế bào có biểu hiện sau đó được phá vỡ bằng sóng siêu âm, phần dịch phá vỡ (Dịch pv) vẫn xuất hiện băng protein tái tổ hợp được tinh sạch trên cột nickel. Kết quả tinh sạch proteins KOD-His ở đường chạy cuối cùng (Dịch tinh sạch) cho thấy vẫn còn rất nhiều băng phụ. Do đó, chúng tôi đã tăng nồng độ Urea lên 4M, kết quả được thể hiện ở Hình 21- B cho thấy protein KOD tinh sạch (mẫu Dịch tinh sạch) đều vẫn còn protein tạp.
A B
Hình 23: Kết quả tinh sạch protein KOD-His ở điều kiện biến tính.
A – Kết quả tinh sạch KOD-His trong điều kiện biến tính sử dụng Urea nồng độ 2M, protein KOD-His tinh sạch được thể hiện ở giếng cuối (Dịch tinh sạch). B – Kết quả tinh sạch KOD-His trong điều kiện biến tính với Urea nồng độ 4M, protein sau tinh sạch được điện di ở giếng cuối (Dịch tinh sạch).
Kết quả điện di SDS-PAGE ở Hình 24 so sánh protein tinh sạch ở điều kiện không biến tính và biến tính trên cột Nickel. Kết quả cho thấy protein KOD-His khi tinh sạch ở điều kiện biến tính (Elute 2M, 4M, 6M) băng protein phụ có mờ đi nhưng băng protein tái tổ hợp cũng giảm đi so với protein tinh sạch ở điều kiện thường (Elute).
Hình 24: Kết quả tinh sạch KOD-His ở điều kiện biến tính và không biến tính. M: thang chuẩn protein, Elute: Dịch tinh sạch protein KOD-His so sánh với dịch tinh sạch