Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.5.2.1. Phương pháp điều chế môi trường
- Môi trường PDA
Thành phần: + Khoai tây : 200 gram + Agar : 20 gram + Glucose : 20 gram + Nước cất : 1000ml - Môi trường PCA và nước chiết lá hồng:
Thành phần: + Khoai tây : 10 gram + Cà rốt : 10 gram + Lá hồng sạch : 50 gram + Agar : 20 gram + Nước cất : 1000ml
- Môi trường WA
Thành phần + Agar : 20 gram + Nước cất : 1000 ml
Môi trường MA
Thành phần (đây là môi trường được tổng hợp sẵn) + MA : 40 gram + Nước cất : 1000 ml
* Cách điều chế môi trường PGA: khoai tây gọt sạch vỏ, rửa sạch, cân đủ lượng cần dung (200 gram), thái nhỏ đun với lượng nước cất đã tính đến sôi trong thời gian 20 phút. Đổ ra lọc lấy dịch trong, them đủ nước (1000ml) rồi đun sôi trở lại, cho đường glucose, agat, đun sôi và khuấy đều cho đến khi tan hết agar. Sau đó đổ môi trường đã nấu vào các bình tam giác (đã được rửa sạch, sấy khô 180 độ C trong 3 giờ). Đem các bình tam giác chứa môi trường hấp khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 độ C (tương đương áp suất 1,5 atm) trong 30 phút. Các môi trường khác cũng điều chế tương tự.
3.5.2.2. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm trên môi trường nhân tạo
Các mẫu bệnh thu thập trong quá trình điều tra được sử dụng làm nguyên liệu để tiến hành phân lập nấm bệnh. Chọn các mẫu bệnh đặc trưng còn tươi mới. Tiến hành rửa sạch mẫu bệnh, rửa lại bằng nước cất vô trùng và thấm khô mẫu bệnh. Cắt các mẫu bệnh kích thước 1 - 2 mm x 1 - 2 mm (lấy phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ). Khử trùng bằng cồn 700 trong 5-10 giây, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng. Dùng que cấy đã khử trùng cấy mô bệnh vào môi trường PGA và để ở điều kiện nhiệt độ thích hợp. Sau khi sợi nấm đã mọc trên môi trường nuôi cấy, dùng que cấy đã khử trùng cắt phần đầu sợi nấm cấy chuyển sang môi trường PGA. Cấy truyền 3 – 4 lần cho đến khi nhận được nấm thuần. Dùng kính hiền vi để xác định những đặc điểm hình thái đặc trưng của nấm.
3.5.2.3. Lây bệnh nhân tạo
Sau khi có nguồn nấm thuần khiết (isolate) nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo PGA, tiến hành tạo dung dịch bào tử bằng cách pha loãng bào tử nấm với nước cất trong ống nghiệm hoặc hộp lồng petri. Đảm bảo mật độ bào tử 104-105/ml.
+ Công thức 1: Sát thương;
+ Công thức 2: Không sát thương;
+ Công thức 3: Đối chứng lây bệnh bằng nước cất.
Dùng bông thấm nước vô trùng nhúng vào dung dịch bào tử đã chuẩn bị sẵn, đặt miếng bông có dung dịch bào tử lên lá khỏe trồng trong chậu, dùng bang dính nilon cố định miếng bông lại.
Mỗi công thức lây 10 lá, 3 lần nhắc lại.
3.5.2.4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm
- Sử dụng nguồn nấm thuần khiết cấy vào giữa hộp petri với đường kính đục lỗ 5mm trên các môi trường PGA và WA
- 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại có 1 hộp petri. - Chỉ tiêu theo dõi:
+ Hình thái, màu sắc tản nấm
+ Đo đường kính tản nấm sau 1, 2, 3, 4, 5 ngày. + Đơn vị đo: mm.
3.5.2.5. Ảnh hưởng của thuốc hóa học đến sự phát sinh phát triển của nấm
- Tính toán nồng độ ( liều lượng ) và cân đủ trọng lượng thuốc hóa học cần thí nghiệm cho từng công thức.
- Sau đó đổ môi trường PGA đã khử trùng vào các bình tam giác có vạch định mức để nguội dần.
- Khi môi trường PGA đã nguội (600C) tiến hành cho thuốc thí nghiệm vào bình ( hoặc lượng dung dịch mẹ đã tính đủ cho từng công thức), lắc đều môi trường.
- Sau đó đổ ra các hộp petri, để môi trường đông cứng, rồi cấy nguồn nấm thuần với đường kính đục lỗ 5mm vào giữa hộp petri đó.
- Tiến hành thử 3 loại thuốc: Anvil 5SC, Daconil 75WP và Ridomil Gold 68WG
Thí nghiệm được tiến hành gồm 4 công thức:
+ Công thức 1: Anvil 5SC ở các nồng độ 200ppm, 600ppm và 800ppm + Công thức 2: Daconil 75WP ở các nồng độ 200ppm, 600ppm và 800ppm
+ Công thức 3: RidomilGold 68WG ở các nồng độ 200ppm, 600ppm và 800ppm
+ Công thức 4: Đối chứng ( môi trường PGA không dùng thuốc) - Mỗi công thức có 3 lấn nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri. - Chỉ tiêu theo dõi: Đo kích thước tản nấm sau cấy 1, 2, 3, 4, 5 ngày ( đơn vị : mm).