Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

3.3.1. Đối tượng nghiên cứu

Nấm gây bệnh đốm đen hoa hồng Marssonina rosae tại thành phố Yên Bái – tỉnh Yên Bái.

3.3.2. Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu bệnh đốm đen hoa hồng được thu thập trên các cây hoa hồng bị nhiễm bệnh tại thành phố Yên Bái – tỉnh Yên Bái.

- Vật liệu nuôi cấy: WA, PGA

- Dụng cụ thí nghiệm: que khêu nấm, hộp petri, dao, thớt, panh, lam kính, lamen, giấy đặt ẩm, kính hiển vi, kính lúp soi nổi và một số vật tư thiết yếu khác.

- Một số thuốc BVTV phòng trừ nấm bệnh:

+ Ridomil Gold 68WG (Metalaxyl M 40g/L + Mancozeb 640g/L) + Anvil 5SC (50g/L Hexaconazole)

+ Daconil 75WP (Chlorothalonil (min 98%)).

3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Điều tra thành phần, mức độ phổ biến bệnh nấm hại hoa hồng.

- Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố canh tác, giống, phân bón, thời vụ ... đến bệnh đốm đen hại cây hoa hồng.

- Khảo sát khả năng phòng trừ bệnh đốm đen bằng thuốc hóa học trong điều kiện đồng ruộng.

- Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự sinh trưởng của nấm Marssonina rosae.

- Khảo sát ảnh hưởng của một số thuốc trừ nấm đến sự phát triển của nấm

Marssonina rosae trên môi trường PGA. - Lây bệnh nhân tạo.

3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu ngoài đồng ruộng

3.5.1.1. Phương pháp điều tra tình hình canh tác hoa hồng và tình hình sử dụng thuốc BVTV của người dân

- Điều tra theo phương pháp sử dụng phiếu câu hỏi. Số hộ nông dân tham gia tra lời phiếu là 30 nông dân, tại vùng trồng hoa Yên Bái.

- Điều tra tình hình sử dụng thuốc và các loại thuốc thường sử dụng của người dân.

3.5.1.2. Phương pháp điều tra thành phần và đánh giá mức độ phổ biến bệnh

- Điều tra thành phần bệnh: Áp dụng phương pháp điều tra theo QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT. Khi điều tra tiến hành thu thập mẫu bệnh hại mang về phòng thí nghiệm để ẩm sau đó giám định vi sinh vật gây bệnh.

- Phân cấp bệnh: Cấp 1: < 1% diện tích lá bị hại. Cấp 3: 1 đến 5% diện tích lá bị hại. Cấp 5: > 5 đến 25% diện tích lá bị hại. Cấp 7: > 25 đến 50% diện tích lá bị hại. Cấp 9: > 50% diện tích lá bị hại.

3.5.1.3. Phương pháp điều tra diễn biến bệnh

- Điều tra định kỳ 7 ngày 1 lần theo phương pháp 10 điểm chéo góc. Mỗi điểm điều tra 5 cây, mỗi cây 1 cành cố định, đếm số lá bị bệnh/tổng lá điều tra.

- Tính TLB(%) và CSB(%).

Lưu ý: Các điều tra được tiến hành trên cây hoa hồng mới ( là cành hoa hồng xuất hiện sinh trưởng sau khi thu hoạch hoa lứa trước, trên một gốc hoa hồng), việc theo dõi cành hoa này được đánh dấu cố định theo dõi từ khi cành hoa mới xuất hiện được 5-7 ngày.

3.5.1.4. Điều tra ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát sinh phát triển của bệnh đốm đen hoa hồng trên đồng ruộng

a. Ảnh hưởng của vùng trồng tới diễn biến bệnh đốm đen hại hoa hồng

Điều tra diễn biến bệnh đốm đen hại hoa hồng tại 2 xã của thành phố Yên Bái là xã Tuy Lộc và xã Minh Bảo.

Điều tra định kỳ 7 ngày 1 lần theo phương pháp 10 điểm chéo góc. Mỗi điểm điều tra 5 cây, mỗi cây 1 cành cố định, đếm số lá bị bệnh/tổng lá điều tra. Chỉ tiêu theo dõi: TLB (%), CSB (%).

b. Ảnh hưởng của giống hoa tới diễn biến bệnh đốm đen hại hoa hồng

Thí nghiệm gồm 3 giống: CT1: Giống hồng đỏ Pháp CT2: Giống hồng Tỉ muội

CT3: Giống hồng Trắng Trung Quốc

c. Ảnh hưởng của tuổi hoa tới diễn biến bệnh đốm đen hại hoa hồng

Thí nghiệm gồm 2 công thức: CT1: hồng tuổi 1

CT2: hồng tuổi 3

d. Ảnh hưởng của mật độ trồng tới diễn biến bệnh đốm đen hại hoa hồng

Thí nghiệm gồm 2 công thức: CT1: 20x30 cm

CT2: 30x30 cm

Giống điều tra: Trắng Trung Quốc.

e. Ảnh hưởng của nền đất canh tác tới diễn biến bệnh đốm đen hại hoa hồng

Thí nghiệm gồm 2 công thức: CT1: Đất vàn cao

CT2: Đất vàn thấp

Giống điều tra: Giống hồng đỏ Pháp

f. Ảnh hưởng của phương pháp tưới tới diễn biến bệnh đốm đen hại hoa hồng

Thí nghiệm gồm 2 công thức: CT1: Tưới rãnh

CT2: Tưới phun

Giống điều tra: Giống hồng đỏ Pháp

g Ảnh hưởng của việc cắt tỉa tới diễn biến bệnh đốm đen hại hoa hồng

Thí nghiệm gồm 2 công thức: CT1: Cắt tỉa

CT2: Không cắt tỉa

Giống điều tra: Giống hồng đỏ Pháp.

h. Ảnh hưởng của liều lượng phân đạm tới diễn biến bệnh đốm đen hoa hồng

Thí nghiệm gồm 3 công thức: CT1: 110kg N/ha

CT2: 180kg N/ha CT3: 260kg N/ha

i. Khảo sát hiệu lực của một số loại thuốc hóa học trong phòng trừ bệnh đốm đen hoa hồng

Thiết kế thí nghiệm theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCB), mỗi công thức nhắc lại 3 lần . Mỗi lần nhắc lại có diện tích ô thí nghiệm 30m2.

Thí nghiệm gồm 4 công thức (Các thuốc hóa học đều được xử lý ở nồng độ và phương pháp khuyến cáo)

CT1: Anvil 5SC (50g/L Hexaconazole)

CT2: Ridomil Gold 68WG (Metalaxyl M 40g/L + Mancozeb 640g/L) CT3: Daconil 75WP (Chlorothalonil (min 98%))

CT4: Đối chứng không sử dụng thuốc hóa học

Điều tra trước phun 1 ngày, sau khi phun thuốc 7 ngày và 14 ngày, theo phương pháp 5 điểm chéo góc. Mối điểm điều tra 5 cây, mỗi cây 1 cành cố định, đếm số lá bị bệnh/tổng lá điều tra. Chỉ tiêu theo dõi: TLB (%), CSB (%).Tính hiệu lực thuốc (%) theo công thức Henderson – Tilton.

3.5.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

3.5.2.1. Phương pháp điều chế môi trường

- Môi trường PDA

Thành phần: + Khoai tây : 200 gram + Agar : 20 gram + Glucose : 20 gram + Nước cất : 1000ml - Môi trường PCA và nước chiết lá hồng:

Thành phần: + Khoai tây : 10 gram + Cà rốt : 10 gram + Lá hồng sạch : 50 gram + Agar : 20 gram + Nước cất : 1000ml

- Môi trường WA

Thành phần + Agar : 20 gram + Nước cất : 1000 ml

Môi trường MA

Thành phần (đây là môi trường được tổng hợp sẵn) + MA : 40 gram + Nước cất : 1000 ml

* Cách điều chế môi trường PGA: khoai tây gọt sạch vỏ, rửa sạch, cân đủ lượng cần dung (200 gram), thái nhỏ đun với lượng nước cất đã tính đến sôi trong thời gian 20 phút. Đổ ra lọc lấy dịch trong, them đủ nước (1000ml) rồi đun sôi trở lại, cho đường glucose, agat, đun sôi và khuấy đều cho đến khi tan hết agar. Sau đó đổ môi trường đã nấu vào các bình tam giác (đã được rửa sạch, sấy khô 180 độ C trong 3 giờ). Đem các bình tam giác chứa môi trường hấp khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 độ C (tương đương áp suất 1,5 atm) trong 30 phút. Các môi trường khác cũng điều chế tương tự.

3.5.2.2. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm trên môi trường nhân tạo

Các mẫu bệnh thu thập trong quá trình điều tra được sử dụng làm nguyên liệu để tiến hành phân lập nấm bệnh. Chọn các mẫu bệnh đặc trưng còn tươi mới. Tiến hành rửa sạch mẫu bệnh, rửa lại bằng nước cất vô trùng và thấm khô mẫu bệnh. Cắt các mẫu bệnh kích thước 1 - 2 mm x 1 - 2 mm (lấy phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ). Khử trùng bằng cồn 700 trong 5-10 giây, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng. Dùng que cấy đã khử trùng cấy mô bệnh vào môi trường PGA và để ở điều kiện nhiệt độ thích hợp. Sau khi sợi nấm đã mọc trên môi trường nuôi cấy, dùng que cấy đã khử trùng cắt phần đầu sợi nấm cấy chuyển sang môi trường PGA. Cấy truyền 3 – 4 lần cho đến khi nhận được nấm thuần. Dùng kính hiền vi để xác định những đặc điểm hình thái đặc trưng của nấm.

3.5.2.3. Lây bệnh nhân tạo

Sau khi có nguồn nấm thuần khiết (isolate) nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo PGA, tiến hành tạo dung dịch bào tử bằng cách pha loãng bào tử nấm với nước cất trong ống nghiệm hoặc hộp lồng petri. Đảm bảo mật độ bào tử 104-105/ml.

+ Công thức 1: Sát thương;

+ Công thức 2: Không sát thương;

+ Công thức 3: Đối chứng lây bệnh bằng nước cất.

Dùng bông thấm nước vô trùng nhúng vào dung dịch bào tử đã chuẩn bị sẵn, đặt miếng bông có dung dịch bào tử lên lá khỏe trồng trong chậu, dùng bang dính nilon cố định miếng bông lại.

Mỗi công thức lây 10 lá, 3 lần nhắc lại.

3.5.2.4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm

- Sử dụng nguồn nấm thuần khiết cấy vào giữa hộp petri với đường kính đục lỗ 5mm trên các môi trường PGA và WA

- 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại có 1 hộp petri. - Chỉ tiêu theo dõi:

+ Hình thái, màu sắc tản nấm

+ Đo đường kính tản nấm sau 1, 2, 3, 4, 5 ngày. + Đơn vị đo: mm.

3.5.2.5. Ảnh hưởng của thuốc hóa học đến sự phát sinh phát triển của nấm

- Tính toán nồng độ ( liều lượng ) và cân đủ trọng lượng thuốc hóa học cần thí nghiệm cho từng công thức.

- Sau đó đổ môi trường PGA đã khử trùng vào các bình tam giác có vạch định mức để nguội dần.

- Khi môi trường PGA đã nguội (600C) tiến hành cho thuốc thí nghiệm vào bình ( hoặc lượng dung dịch mẹ đã tính đủ cho từng công thức), lắc đều môi trường.

- Sau đó đổ ra các hộp petri, để môi trường đông cứng, rồi cấy nguồn nấm thuần với đường kính đục lỗ 5mm vào giữa hộp petri đó.

- Tiến hành thử 3 loại thuốc: Anvil 5SC, Daconil 75WP và Ridomil Gold 68WG

Thí nghiệm được tiến hành gồm 4 công thức:

+ Công thức 1: Anvil 5SC ở các nồng độ 200ppm, 600ppm và 800ppm + Công thức 2: Daconil 75WP ở các nồng độ 200ppm, 600ppm và 800ppm

+ Công thức 3: RidomilGold 68WG ở các nồng độ 200ppm, 600ppm và 800ppm

+ Công thức 4: Đối chứng ( môi trường PGA không dùng thuốc) - Mỗi công thức có 3 lấn nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 1 hộp petri. - Chỉ tiêu theo dõi: Đo kích thước tản nấm sau cấy 1, 2, 3, 4, 5 ngày ( đơn vị : mm).

3.5.3. Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá

- Tỷ lệ bệnh: A TLB (%) = (---) x 100 B Trong đó: A là số lá bị bệnh B là tổng số lá điều tra - Chỉ số bệnh: CSB = ∑ (N1 x 1) + (N3 x 3) +…+ (Nn x n) N x n x 100 Trong đó: N1 là số lá bị bệnh ở cấp 1; N3 là số lá bị bệnh ở cấp 3; Nn là số bị bệnh ở cấp n. N là tổng số lá điều tra. n là cấp bệnh cao nhất (cấp 9). * Thang phân cấp bệnh điều tra trên lá:

Cấp 1: < 1% diện tích lá bị hại. Cấp 3: 1 đến 5% diện tích lá bị hại. Cấp 5: > 5 đến 25% diện tích lá bị hại. Cấp 7: > 25 đến 50% diện tích lá bị hại.

- Hiệu lực phòng trừ của thuốc hoá học đối với bệnh ngoài đồng công thức theo công thức Henderson – Tilton:

HLPT (%) = 1 x100 TbxCa TaxCb        Trong đó : HLPT (%): Hiệu lực phòng trừ (%)

Ta: Mức độ bệnh (%) của công thức thí nghiệm sau xử lý Tb: Mức độ bệnh (%) của công thức thí nghiệm trước xử lý Ca: Mức độ bệnh (%) của công thức đối chứng sau xử lý Cb: Mức độ bệnh (%) của công thức đối chứng trước xử lý - Xử lý thống kê số liệu theo chương trình IRRISTAT 5.0.

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. THÀNH PHẦN BỆNH NẤM HẠI HOA HỒNG TẠI YÊN BÁI VỤ ĐÔNG XUÂN 2016-2017 ĐÔNG XUÂN 2016-2017

Chúng tôi tiến hành điều tra một số xã trồng hoa hồng tại thành phố Yên Bái –tỉnh Yên Bái vào vụ Đông xuân năm 2016-2017 cho thấy thành phần nấm bệnh ở những vùng này khá phong phú. Nhìn chung thời tiết vụ Đông xuân 2016- 2017 độ ẩm cao, mưa nhiều, thuận lơi cho các bệnh nấm về hoa hồng phát triển. Kết quả được tŕnh bày ở bảng 4.1.

Bảng 4.1. Thành phần bệnh nấm hại hoa hồng tại Yên Bái vụ đông xuân 2016-2017

STT Tên bệnh Tên khoa học Tên bộ Bộ phận

bị hại

Mức độ phổ biến

1 Đốm đen Marssonina rosae

(Lib.)Lind. Sphaeriales

Lá, thân,

đế hoa +++

2 Phấn trắng

Sphaerotheca pannosa var rosae

Wor. Erysiphales Lá, hoa, cành ++ 3 Bệnh gỉ sắt Phragmidium mucronatum (Pers.) Shltdl Uredinales Lá, cuống, cành + 4 Bệnh thối xám Botrytis cinerea Pers. Moniliales Nụ, lá, cành +

5 Thán thư Colletotrichum sp Melanconiales Lá +

Ghi chú: + bệnh ít phổ biến TLB<5% ++ bệnh khá phổ biến TLB: 5-25%

+++ bệnh phổ biến TLB>25%

Từ bảng 4.1, chúng tôi nhận thấy vụ Đông Xuân 2016-2017 tại Yên Bái xác định được thành phần nấm bệnh trên hoa hồng gồm 5 bệnh. Trong đó bệnh đốm đen là bệnh có mức phổ biến cao nhất. Bệnh phấn trắng xuất hiện ở mức độ trung bình. Bệnh thối xám, bệnh thán thư, gỉ sắt là những bệnh xuất hiện không phổ biến.

4.1.1. Bệnh gỉ sắt (Phragmidium mucronatum (Pers.) Shltdl)

Bệnh gỉ sắt hại cây hoa hồng thường phát sinh phá hại nặng trong điều kiện nhiệt độ, ẩm độ khá cao, cây thiếu ánh sáng, cây trồng trên chân đất trũng, chậm thoát nước. Bệnh gây hại nặng vào giai đoạn thu hoạch khi nông dân ngừng phun các loại thuốc bảo vệ thực vật. Ban đầu mặt trên của lá (đặc biệt là những lá già) xuất hiện những chấm nhỏ mầu vàng,hình thái bất định sau đó mặt dưới của lá nổi dần lên thành những cục u nhỏ xíu, bên trong chứa một loại bột, bóp ra thấy có mầu da cam hoặc mầu nâu đỏ, giống như mầu rỉ sét của sắt, những lá nào bị nhiều vết này thì lá dần trở nên vàng úa và rụng sớm, cây nào bị nhiều thì cây trở nên xơ xác. Ngoài phiến lá nấm bệnh còn tấn công trên cả cuống lá... và đôi khi trên cả vỏ thân cây

Hình 4.1. Bào tử hạ nấm gỉ sắt

(Phragmidium mucronatum) Hình 4.2. Bào tử đông nấm gỉ sắt (Phragmidium mucronatum)

4.1.2. Bệnh thán thư (Colletotrichum sp.)

Vết bệnh là những đốm hình tròn màu vàng nâu hoặc nâu nhạt, đường kính vết bệnh khoảng 2 – 5mm, có viền gờ nổi lên. Khi bệnh nặng, vết bệnh lan rộng có hình dạng bất định màu nâu hoặc màu nâu đen. Bệnh thường hại các lá già gần gốc trước rồi lan dần lên các lá phía trên.

Hình 4.4. Triệu chứng bệnh thán thư trên lá hoa hồng

4.1.3. Bệnh đốm đen lá (Marssonina rosae)

Triệu chứng dễ nhận biết là vết bệnh có hình tròn màu đen hoặc xám, quanh đốm có lớp lông nhung nhỏ, bên ngoài viền vàng, đường kính vết bệnh từ

Bệnh thán thư (Colletotrichum rosae)

Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm