PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA
4.1.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào của những chủng giống gốc sản xuất
vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
Hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 nghiên cứu đã được phân lập từ chó mắc bệnh Care ngoài thực địa. Hai chủng giống gốc này
đang ở đời cấy truyền P#5 và được bảo quản ở điều kiện -800C. Trong nghiên
cứu này, nhằm đánh giá được khả năng gây bệnh tích tế bào và nhân lên của virus trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST, nghiên cứu đã sử dụng chủng virus vacxin Onderstepoort được phân lập từ vacxin thương mại để so sánh với hai chủng giống gốc nghiên cứu. Kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào của hai chủng giống gốc nghiên cứu và chủng virus vacxin được thể hiện ở hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào của hai chủng giống gốc nghiên cứu và chủng virus vacxin Onderstepoort
Ghi chú:
B: Tế bào bong chóc hoàn toàn khỏi bề mặt nuôi cấy; CPE: bệnh tích tế bào (%). *: Sai khác có ý nghĩa thống kê giữa chủng virus vacxin Onderstepoort và các chủng giống gốc nghiên cứu, với giá trị P < 0,05.
****: Sai khác có ý nghĩa thống kê giữa chủng virus vacxin Onderstepoort và các chủng giống gốc nghiên cứu, với giá trị P < 0,0001.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng giống gốc nghiên cứu có khả năng gây bệnh tích tế bào tương đối giống nhau nhưng có sự sai khác với chủng virus vacxin Onderstepoort. Khi xem xét tại các thời điểm khác nhau sau khi gây nhiễm hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort nhận thấy có sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Sau 12 giờ gây nhiễm, chủng virus VNUA-CDV- 04 có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với chủng virus VNUA-CDV-03 và chủng virus vacxin Onderstepoort. Thời điểm sau 24, 36 và 48 giờ sau khi gây nhiễm, hai chủng giống gốc không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với nhau, hai chủng giống gốc có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với chủng virus vacxin Onderstepoort. Sau 60 và 72 giờ gây nhiễm, do chủng virus vacxin Onderstepoort đã phá huỷ và làm bong chóc toàn bộ tế bào khỏi bề mặt nuôi cấy nên không thể so sánh được về sự sai khác với hai chủng giống gốc nghiên cứu.
Chủng virus VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 bắt đầu gây bệnh tích tế bào sau 12 giờ gây nhiễm, phá hủy 50-55% tế bào nuôi cấy sau 36 giờ gây nhiễm (hình 4.2 và 4.3), bệnh tích tế bào đạt 90% sau 48 giờ gây nhiễm (hình 4.4 và 4.5) và phá hủy toàn bộ tế bào (CPE là 100%) sau 60-72 giờ gây nhiễm (hình 4.6 và 4.7). Trong khi đó, chủng virus vacxin Onderstepoort xuất hiện bệnh tích tế bào sau 12 giờ gây nhiễm, bệnh tích tế bào đạt 50% sau 24 giờ gây nhiễm, bệnh tích tế bào đạt 90% sau 36 giờ gây nhiễm và bệnh tích tế bào đạt 100% sau 48 giờ gây nhiễm. Kết quả so sánh cho thấy chủng virus vacxin có thời gian phá hủy tế bào nhanh hơn so với hai chủng giống gốc nghiên cứu, điều này có thể được lý giải là do chủng virus vacxin đã được thuần hóa và nuôi cấy nhiều đời trên môi trường nuôi cấy nhân tạo nên có khả năng thích ứng nhanh hơn so với các chủng virus được phân lập từ thực địa. Khi so sánh về nguồn gốc mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập của hai chủng giống gốc nghiên cứu nhận thấy không có sự sai khác về khả năng gây bệnh tích tế bào trên môi trường nuôi cấy dòng tế bào Vero- DST. Điều này có thể do dòng tế bào Vero-DST phù hợp để phân lập virus Care
từ các mẫu bệnh phẩm của chó bệnh (Seki et al., 2003).
Bệnh tích tế bào quan sát được sau thời gian gây nhiễm hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort là kiểu syncytium - thể hợp bào với biểu hiện là các tế bào co cụm lại, màng tế bào bị tan rã, các nhân tế bào co cụm lại, tế bào không bám được vào đáy bình nuôi cấy, sau đó tế bào bị phá hủy và bong tróc khỏi bề mặt đáy bình nuôi cấy. Khi so sánh với khả năng gây bệnh tích tế bào của hai chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 với chủng virus CDV-HN1,
Vn86 và Vn99 đã được phân lập tại Việt Nam năm 2008 (Lan et al., 2008,
2009a) và XJ2 tại Trung Quốc năm 2010 (Qiao et al., 2010), kết quả cho thấy
hai chủng giống gốc nghiên cứu gây bệnh tích tế bào kiểu hợp bào giống với 4 chủng virus trên. Tuy nhiên thời gian để hai chủng giống gốc phá hủy 90-95% tế bào là chậm hơn so với hai chủng Vn86 và Vn99 (CPE đạt 90-95% sau 24 giờ gây nhiễm) nhưng nhanh hơn so với chủng XJ2 (thể hợp bào xuất hiện sau 72 giờ gây nhiễm).
Một số hình ảnh bệnh tích tế bào do hai chủng giống gốc gây ra trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST
Hình 4.2. CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 4.3. CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 4.4. CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 4.5. CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 4.6. CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 60 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 4.7. CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 60 giờ gây nhiễm (10X) 4.1.2. Hiệu giá của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
Bên cạnh việc đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào, nghiên cứu đã tiến hành xác định hiệu giá virus của hai chủng virus VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04. Kết quả xác định hiệu giá virus được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu
STT Chủng virus Hiệu giá virus
(TCID50/25µl)
1 VNUA-CDV-03 3,16 x 104
2 VNUA-CDV-04 1,47 x 104
3 Onderstepoort 6,67 x 104
Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy hai chủng giống gốc có hiệu giá virus tương đối cao. Hiệu giá virus của hai chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 thấp hơn so với các chủng virus Care phân lập được tại Việt Nam trước đây như
CDV-HN1 (3.16 x 105 TCID50/25ul) (Lan et al., 2008), Vn86 và Vn99 (Lan et
al., 2009a). Khi so sánh về nguồn gốc các mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập virus, nhận thấy 3 chủng virus CDV-HN1, Vn86 và Vn99 được phân lập từ phổi, não và hạch phổi có hiệu giá virus cao hơn so với hai chủng giống gốc được phân lập từ ruột và phổi. Điều này góp phần làm sáng tỏ các cơ quan đích tấn công, phân bố và tập trung của virus Care trong cơ thể chó bệnh và sự phân bố này là không đồng đều nhau.
4.1.3. Kết quả xác định quy luật nhân lên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
Trong nghiên cứu đặc tính sinh học của virus thì việc xác định được quy luật nhân lên của virus trên môi trường nuôi cấy là vô cùng quan trọng, điều này giúp cho các nhà nghiên cứu xác định được tương đối chính xác các pha trong quá trình nhân lên của virus. Kết quả xây dựng đường biểu diễn quy luật nhân lên của hai chủng giống gốc nghiên cứu so với chủng virus vacxin Onderstepoort được trình bày ở hình 4.8 và 4.9.
Kết quả nghiên cứu quy luật cho thấy hai chủng giống gốc nghiên cứu có quy luật nhân lên sai khác với chủng virus vacxin Onderstepoort tại các thời điểm thu hoạch virus khác nhau sau khi gây nhiễm. Trong đó, thời điểm 24, 36 và 48 giờ sau khi gây nhiễm, hai chủng giống gốc có pha nhân lên trong tế bào sai khác với chủng virus vacxin Onderstepoort có ý nghĩa thống kê. Đối với pha giải phóng tự do ngoài môi trường nuôi cấy thì chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với chủng virus vacxin Onderstepoort lần lượt ở các giai đoạn 48 giờ và 24-36 giờ sau gây nhiễm. Khi xem xét ở từng chủng giống gốc nghiên cứu, nhận thấy có sự sai khác về pha nhân lên trong tế bào và giải phóng tự do ngoài môi trường nuôi cấy tương ứng với chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 lần lượt ở thời điểm 60 giờ và 24 giờ và 48-72 giờ sau khi gây nhiễm. Như vậy, sự tăng trưởng của virus trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST không phải là một quá trình liên tục, đồng đều. Cả hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort đều có pha tấn công, xâm nhập và nhân lên trong tế bào mạnh hay yếu tùy từng thời điểm nhất định.
Chủng VNUA-CDV-03 xâm nhập và nhân lên nhanh trong tế bào Vero- DST sau 24 giờ gây nhiễm, đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm (3,16 x 104 TCID50/25µl), sau đó hàm lượng virus giảm sau 60 giờ gây nhiễm (1,0 x 104
TCID50/25µl). Trong khi đó, hàm lượng virus giải phóng tự do ngoài môi trường
nuôi cấy tăng mạnh sau 24 giờ gây nhiễm, đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm
(1,45 x 104 TCID50/25µl), sau đó hàm lượng virus giảm dần ở thời điểm 60 - 72
giờ sau khi gây nhiễm.
Chủng VNUA-CDV-04 xâm nhập và nhân lên nhanh trong tế bào Vero- DST sau 24 giờ gây nhiễm, đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm (1,45 x 104
TCID50/25µl), hàm lượng virus giảm sau 60 giờ gây nhiễm (3,16 x 103
TCID50/25µl). Trong khi đó, hàm lượng virus giải phóng tự do ngoài môi trường
nuôi cấy tăng mạnh sau 24 giờ gây nhiễm, đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm
(3,16 x 103 TCID50/25µl), sau đó hàm lượng virus giảm dần ở thời điểm 60 - 72
giờ sau khi gây nhiễm.
Khi so sánh về quy luật nhân lên giữa hai chủng giống gốc virus Care với chủng virus vacxin Onderstepoory nhận thấy 3 chủng virus có đặc điểm chung là pha nhân lên trong tế bào luôn chiếm ưu thế với hàm lượng virus tập trung trong tế bào luôn cao hơn hàm lượng virus tập trung ở ngoài tế bào tại các thời điểm thu hoạch virus khác nhau. Hàm lượng virus nhân lên trong tế bào đạt cực đại tại thời điểm 36 - 48 giờ sau khi gây nhiễm, sau đó hàm lượng virus giảm. Có sự sai khác tại thời điểm hàm lượng virus giảm giữa hai chủng virus VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 và chủng virus vacxin Onderstepoort. Kết quả này có ý nghĩa vô cùng quan trọng giúp xác định được thời điểm thích hợp để thu hoạch virus đạt hiệu giá cao nhất.
Quy luật nhân lên của hai chủng giống gốc nghiên cứu có sự sai khác với các chủng virus 007Lm (genotype Asia 2), chủng S124C (genotype Asia 1) và
Vn86 (genotype Classic) được phân lập trước đây trong những nghiên cứu Lan et
al. (2006b, 2009a) về hiệu giá virus và thời điểm đạt cực đại ở pha nhân lên trong tế bào và giải phóng tự do ngoài tế bào. Trong đó, chủng 007Lm có hàm lượng virus trong tế bào và giải phóng tự do ngoài môi trường đạt cực đại tại thời điểm 48 giờ sau khi gây nhiễm (3,16 x 106 TCID50/ml và 1,45 x 106 TCID50/ml). Chủng S124C có hàm lượng virus trong tế bào và giải phóng tự do ngoài môi trường đạt cực đại tại thời điểm 48 giờ sau khi gây nhiễm (6,76 x 102 TCID50/ml
và 3,16 x 102 TCID50/ml). Chủng Vn86 có hàm lượng virus trong tế bào và giải
phóng tự do ngoài môi trường nuôi cấy đạt cực đại sau 24 giờ gây nhiễm với giá trị lần lượt là 3,16 x 106 TCID50/ml và 3,16 x 105 TCID50/ml.
Khi so sánh về kết quả quy luật nhân lên của hai chủng giống gốc và thời gian xuất hiện bệnh tích tế bào (mục 4.1.1) nhận thấy có mối tương quan về thời điểm xuất hiện bệnh tích tế bào đạt 80-90% và hiệu giá virus sẽ giảm mạnh khi bệnh tích tế bào đạt 100%. Do đó cần tiến hành thu hoạch virus sau thời gian 36- 48 giờ sau khi gây nhiễm virus kết hợp với các phương pháp phá vỡ tế bào trong quá trình thu hoạch nhằm thu được hiệu giá virus cao nhất.
Hình 4.8. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus VNUA-CDV-03 và chủng virus vacxin Onderstepoort
Hình 4.9. Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus VNUA-CDV-04 và chủng virus vacxin Onderstepoort
Ghi chú:
a: Sai khác có ý nghĩa thống kê giữa virus trong tế bào và virus ngoài tế bào của các chủng virus nghiên cứu. b: Sai khác có ý nghĩa thống kê giữa virus trong tế bào của chủng virus nghiên cứu và chủng virus vacxin Onderstepoort. c: Sai khác có ý nghĩa thống kê giữa virus ngoài tế bào của chủng virus nghiên cứu và chủng virus vacxin Onderstepoort. *: Sai khác có ý nghĩa thống kê với giá trị P < 0,05. **: Sai khác có ý nghĩa thống kê với giá trị P < 0,01. ***: Sai khác có ý nghĩa thống kê với giá trị P < 0,001. ****: Sai
4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE
4.2.1. Kết quả giải trình tự gene của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care vô hoạt phòng bệnh Care
Nghiên cứu của Von Messling et al. (2001) đã chỉ ra trong cấu trúc bộ gene của virus Care, protein mã hóa từ gene H và P có chức năng chính đó là quyết định tới tính ái lực và khả năng gây bệnh tích tế bào của virus Care. Sự thay đổi về cấu trúc protein mã hóa từ gene H sẽ dẫn tới sự thay đổi về tính
kháng nguyên của virus (Blixenkrone-Møller et al., 1992). Ngược lại, gene P là
gene bảo thủ trong cấu trúc của virus Care (Carpenter et al., 1998). Chính vì vậy, trong nghiên cứu này đã tiến hành giải trình tự gene H và P của virus Care nhằm đánh giá được cấu trúc và dữ liệu di truyền của hai chủng giống gốc nghiên cứu so với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705). Kết quả phản ứng RT-PCR đối với gene H và P của hai chủng giống gốc được trình bày ở hình 4.10 và 4.11.
Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với gene H phản ứng RT-PCR với gene H
Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR với gene P phản ứng RT-PCR với gene P
Ghi chú: M: Thang Marker (0,1 - 2 kpb); giếng 1, 2 tương ứng với chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 virus nghiên cứu. Giếng 3: Đối chứng âm là nước khử ion. Giếng 4: Đối chứng dương là
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR ở hình 4.10 và 4.11 cho thấy hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 đều cho một vạch band sáng tương ứng với kích thước thiết kế của gene H và P với kích thước lần lượt là 2100 bp và 409 bp. Sản phẩm điện di cho thấy tính đặc hiệu của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu với biểu hiện là band sáng gọn gàng, không xuất hiện hiện tượng smear điều này chứng tỏ các thành phần và bước thực hiện phản ứng RT-PCR đã được tối ưu hóa đối với hai đoạn gene nghiên cứu.
Kết quả giản đồ giải trình tự gene cho thấy chất lượng sản phẩm của quá trình giải trình tự gene H và P (hình 4.12) trực tiếp từ sản phẩm của phản ứng RT-PCR tốt, mỗi đỉnh của giản đồ giải trình tự tương ứng với một nucleotide. Trong đó, các nucleotide khác nhau thì sẽ tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser sẽ hiển thị màu tương ứng như Adenin là màu đỏ, Thymine là màu xanh nước biển, Guanine là màu xanh lá cây, Cytosine là màu đen. Đồng thời, khi xem xét khoảng cách giữa các đỉnh màu tương tứng với từng nucleotide là tương đối đồng đều, không xuất hiện các đỉnh có khoảng cách rộng hoặc nhiều đỉnh màu tập trung tại một vị trí nucleotide. Kết quả này cho thấy việc giải trình tự gene trực tiếp từ sản phẩm của phản ứng RT-PCR là phù hợp để giải trình tự nhanh một đoạn gene của virus, giúp rút ngắn thời gian so với việc giải trình tự một đoạn gene bằng cách nhân dòng gene qua tế bào vi