Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu. Trong nghiên cứu này
chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) để phục vụ cho bước giải trình tự gene virus Care. Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gene tự động là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger.
Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau:
Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR:
Bước 1: Cho vào ống Eppendorf sản phẩm RT-PCR và dung dịch PB theo tỷ lệ 1:5 sau đó trộn đều.
Bước 2: Cho hỗn hợp đã trộn vào cột QIA đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút.
Bước 3: Cho 750μl PE vào cột QIA đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Bỏ dung dịch ở đáy ống. Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút.
Bước 4: Chuyển cột sang ống Eppendorf mới. Cho thêm 50 μl EB vào giữa màng để 1 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút (có thể lặp lại 1 lần nữa để đảm bảo lấy hết DNA).
Bước 5: Bỏ cột, lấy dung dịch ở ống Eppendorf (DNA tinh khiết).
Thực hiện phản ứng PCR sequence: Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml theo bảng 3.5.
Bảng 3.5. Thành phần và thể tích cho phản ứng PCR sequence
Thành phần Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
DTCS Quick Start Master Mix 8,0
Mẫu DNA 5,0
Primer* 0,2
dH2O 6,8
Tổng thể tích 20,0
Ghi chú: Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR sequence được trình bày ở bảng 3.2 tương ứng với gene H và P của virus Care.
Với chương trình chạy PCR sequence như bảng 3.6.
Bảng 3.6. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR sequence
Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ
Biến tính chuỗi DNA 960C 20 giây
30 chu kỳ
Gắn mồi 500C 20 giây
Kéo dài chuỗi DNA 600C 4 phút
Tinh sạch sản phẩm PCR sequence:
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter-Mỹ) Các bước tinh sạch sản phẩm như sau:
Bước 1: Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được hỗn hợp với 2 μl
Sodium acetate, 2 μl EDTA Na2 và 1 μl glycogen.
Bước 2: Bổ sung 60 μl cồn 1000 trong điều kiện lạnh và tiến hành ly tâm
14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi trên ống và giữ lại cặn DNA.
Bước 3: Bổ sung 200 μl cồn 750 lạnh, tiến hành ly tâm ở 14000 vòng/phút
trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn.
Bước 4: Lặp lại bước 3 và để DNA khô tự nhiên hoặc đặt trong máy quay khô chân không.
Bước 5: Bổ sung 40 μl SLS vào mỗi mẫu và trộn đều.
Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành giải trình tự.
Phân tích xác nhận chuỗi gene thu được bằng chương trình Blast trên ngân hàng gene (GenBank). Truy cập ngân hàng gene thu nhận và xác định tính tương đồng về nucleotide của các chuỗi gene tương ứng của virus với các phân đoạn gene thu được trong nghiên cứu. Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gene của chủng virus thu nhận bằng phần mềm Genetyx (version 5.0.4) và MEGA6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0). Sử dụng phương pháp test Maximum likehood với giá trị bootstrap là 1000 đơn vị. Các chủng tham chiếu sử dụng (phụ lục 1) để xây dựng cây sinh học phân tử được thu thập từ dữ liệu trên ngân hàng gene thế giới.