Ghi chú: M: Thang Marker (0,1 - 2 kpb); giếng 1, 2 tương ứng với chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 virus nghiên cứu. Giếng 3: Đối chứng âm là nước khử ion. Giếng 4: Đối chứng dương là
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR ở hình 4.10 và 4.11 cho thấy hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 đều cho một vạch band sáng tương ứng với kích thước thiết kế của gene H và P với kích thước lần lượt là 2100 bp và 409 bp. Sản phẩm điện di cho thấy tính đặc hiệu của các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu với biểu hiện là band sáng gọn gàng, không xuất hiện hiện tượng smear điều này chứng tỏ các thành phần và bước thực hiện phản ứng RT-PCR đã được tối ưu hóa đối với hai đoạn gene nghiên cứu.
Kết quả giản đồ giải trình tự gene cho thấy chất lượng sản phẩm của quá trình giải trình tự gene H và P (hình 4.12) trực tiếp từ sản phẩm của phản ứng RT-PCR tốt, mỗi đỉnh của giản đồ giải trình tự tương ứng với một nucleotide. Trong đó, các nucleotide khác nhau thì sẽ tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser sẽ hiển thị màu tương ứng như Adenin là màu đỏ, Thymine là màu xanh nước biển, Guanine là màu xanh lá cây, Cytosine là màu đen. Đồng thời, khi xem xét khoảng cách giữa các đỉnh màu tương tứng với từng nucleotide là tương đối đồng đều, không xuất hiện các đỉnh có khoảng cách rộng hoặc nhiều đỉnh màu tập trung tại một vị trí nucleotide. Kết quả này cho thấy việc giải trình tự gene trực tiếp từ sản phẩm của phản ứng RT-PCR là phù hợp để giải trình tự nhanh một đoạn gene của virus, giúp rút ngắn thời gian so với việc giải trình tự một đoạn gene bằng cách nhân dòng gene qua tế bào vi khuẩn. Chuỗi trình tự sau khi giải trình tự gene được xử lý bằng phần mềm SEQ 8000 và genetyx, được xác thực bằng cách Blast trực tiếp qua ngân hàng gene thế giới, sau đó được lưu trữ trên hệ thống máy chủ để phục vụ cho việc trích xuất và truy cứu dữ liệu.
Hình 4.12. Giản đồ giải trình tự gene tự động đoạn gene Phosphor của chủng virus VNUA-CDV-04
4.2.2. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
Kết quả giải trình tự gene H và P của hai chủng giống gốc có độ dài lần lượt là 1824 bp và 402 bp, kết quả so sánh trình tự nucleotide giữa hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) được thể hiện ở hình 4.13 và 4.14.
Hình 4.13. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene H của hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705)
Ghi chú: Các vị trí nucleotide giống nhau được biểu thị bằng dấu (.); các vị trí có sự sai khác được biểu thị bằng nucleotide tương ứng ở chủng virus đó.
Hình 4.13. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene H của hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) (tiếp theo)
Ghi chú: Các vị trí nucleotide giống nhau được biểu thị bằng dấu (.); các vị trí có sự sai khác được biểu thị bằng nucleotide tương ứng ở chủng virus đó.
Hình 4.13. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene H của hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) (tiếp theo)
Ghi chú: Các vị trí nucleotide giống nhau được biểu thị bằng dấu (.); các vị trí có sự sai khác được biểu thị bằng nucleotide tương ứng ở chủng virus đó. Các vị trí không có nucleotide được đánh dấu bằng
Hình 4.14. So sánh trình tự nucleotide của đoạn gene P của hai chủng giống gốc và và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705)
Ghi chú: Các vị trí nucleotide giống nhau được biểu thị bằng dấu (.); các vị trí có sự sai khác được biểu thị bằng nucleotide tương ứng ở chủng virus đó.
Kết quả so sánh trình tự nucleotide ở gene Haemagglutinin cho thấy hai chủng giống gốc có sự sai khác về thành phần nucleotide và có sai khác với chủng virus vacxin Onderstepoort ở 160 vị trí (chi tiết về các vị trí sai khác được trình bày ở bảng 4.3). Trong đó:
- Chủng VNUA-CDV-03 có 155 vị trí sai khác so với chủng VNUA-CDV- 04 lần lượt ở các vị trí như: 36, 54, 61, 87, 90, 96, 108, 115, 133, 136, 139, 162, 291, 330, 369, 387, 426, 432, 436, 465, 466, 469, 475, 479, 484, 493, 494, 507, 511, 522, 525, 528, 531, 533, 538, 552, 555, 556, 590, 591, 594, 606, 609, 630, 639, 660, 678, 679, 687, 696, 712, 717, 721, 723, 733, 735, 739, 756, 765, 772, 792, 801, 819, 828, 830, 864, 868, 876, 894, 903, 926, 937, 958, 963, 970, 990, 991, 996, 999, 1009, 1024, 1031, 1047, 1053, 1056, 1059, 1074, 1076, 1094, 1095, 1096, 1100, 1116, 1119, 1126, 1127, 1128, 1140, 1156, 1164, 1182, 1194, 1201, 1212, 1243, 1248, 1249, 1272, 1275, 1281, 1299, 1305, 1336, 1356, 1362, 1365, 1375, 1378, 1379, 1399, 1422, 1423, 1424, 1437, 1476, 1491, 1494, 1500, 1505, 1515, 1517, 1528, 1539, 1550, 1557, 1572, 1578, 1584, 1587, 1588, 1590, 1599, 1608, 1644, 1645, 1683, 1711, 1714, 1728, 1738, 1750, 1755, 1756, 1758, 1821.
- Chủng VNUA-CDV-03 có 152 vị trí sai khác so với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) ở các vị trí như: 36, 54, 61, 87, 90, 96, 108, 115, 133, 136, 139, 162, 291, 330, 369, 387, 426, 432, 436, 465, 466, 469, 475, 479, 484, 507, 511, 522, 525, 528, 531, 533, 538, 552, 555, 556, 590, 591, 594, 606, 609, 630, 639, 660, 678, 679, 687, 696, 712, 717, 721, 723, 733, 735, 739, 756, 765, 772, 792, 801, 819, 828, 830, 864, 868, 876, 894, 903, 926, 937, 958, 963, 970, 990, 991, 996, 999, 1009, 1024, 1031, 1047, 1056, 1059, 1074, 1076, 1094, 1095, 1096, 1100, 1116, 1119, 1126, 1127, 1128, 1140, 1156, 1164, 1182, 1194, 1201, 1212, 1243, 1248, 1249, 1272, 1275, 1281, 1299, 1305, 1336, 1356, 1362, 1365, 1375, 1378, 1399, 1422, 1423, 1424, 1437, 1450, 1476, 1491, 1494, 1500, 1505, 1515, 1517, 1528, 1539, 1550, 1557, 1572, 1578, 1584, 1587, 1588, 1590, 1599, 1608, 1644, 1645, 1674, 1683, 1714, 1728, 1738, 1750, 1755, 1756, 1758, 1814.
- Chủng VNUA-CDV-04 có 10 vị trí sai khác so với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) ở các vị trí như: 493, 494, 525, 1053, 1379, 1450, 1674, 1711, 1814, 1821.
Ở gene P, kết quả so sánh trình tự nucleotide cho thấy hai chủng giống gốc có sự sai khác về thành phần nucleotide và sai khác so với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) ở 18 vị trí (chi tiết về các vị trí sai khác được trình bày ở bảng 4.2). Trong đó:
- Chủng VNUA-CDV-03 có 17 vị trí sai khác so với chủng VNUA-CDV-04 ở các vị trí lần lượt là: 49, 55, 129, 174, 183, 216, 225, 230, 243, 246, 253, 269, 288, 307, 308, 344, 356.
- Chủng VNUA-CDV-03 có 17 vị trí sai khác với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) ở các vị trí lần lượt là: 49, 55, 96, 129, 174, 183, 216, 225, 230, 246, 253, 269, 288, 307, 308, 344, 356.
- Chủng VNUA-CDV-04 có 2 vị trí sai khác so với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) ở các vị trí lần lượt là: 96, 243.
Kết quả so sánh về trình tự nucleotide ở đoạn gene H và P giữa hai chủng giống gốc đã chỉ ra sự sai khác về thành phần nucleotide không quá 8,77% và 4,48%. Điều này cho thấy có sự sai khác giữa các chủng virus, các chủng virus có thể nằm trong các nhánh phát sinh khác nhau trên cây phát sinh loài.
Bảng 4.2. Các vị trí sai khác nucleotide của gene P giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705)
Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác
49 G - A 216 G - A 269 T - A 55 A - G 225 G - A 288 C - T 96 T - C 230 A - G 307 G - A 129 G - A 243 T - C 308 A - G 174 A - G 246 G - A 344 G - A 183 G - A 253 A - C 356 C - T
Bảng 4.3. Các vị trí sai khác nucleotide của gene H giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705)
Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác
36 T - C 594 A - T 1024 G – A 1423 A - C 54 T - C 606 C - A 1031 G - A 1424 C - T 61 T - A 609 A - C 1047 T - C 1437 G - A 87 G - A 625 T - C 1053 T - G 1450 A - T 90 A - T 630 A - C 1056 G - T 1476 G - A 96 A - C 639 A - C 1059 C - T 1491 C - T 108 C - T 660 A - G 1074 A - T 1494 G - A
Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác 115 C - T 678 A - C 1076 T - C 1500 G - A 133 C - T 679 A - G 1094 T - C 1505 A - G 136 C - T 687 T - C 1095 A - C 1515 T - C 139 A - G 696 T - C 1096 T - C 1517 C - T 162 C - T 712 T - G 1100 T - C 1528 T - A 166 A - G 717 T - A 1116 G - A 1539 A - G 291 A - G 721 G - A 1119 G - A 1550 A - G 330 A - G 723 G - A 1126 A - G 1557 G - A 369 G - T 733 T - A 1127 A - G 1572 A - G 387 G - A 735 G - T 1128 C - T 1578 T - C 426 A - G 739 A - G 1140 T - A 1584 C - A 432 C - T 756 G - A 1156 T - A 1587 G - A 436 A - G 765 T - C 1164 T - C 1588 G - A 465 T - G 772 C - A 1182 T - A 1590 C - T 466 A - T 792 T - A 1194 T - C 1599 A - G 469 G - A 801 G - A 1201 G - A 1608 C - T 475 G - A 819 C - A 1212 T - A 1644 A - G 479 A - G 828 A - G 1243 C - G 1645 T - C 484 T - G 830 C - A 1248 C - T 1674 A - G 493 T - C 864 C - T 1249 A - G 1683 T - C 494 C - G 868 C - T 1272 A - G 1711 G - A 507 C - T 876 A - G 1275 T - C 1714 G - A 511 A - C 894 T - A 1281 T - C 1728 T - C 522 A - C 903 C - T 1299 C - T 1738 C - A 525 C - A 926 A - G 1305 C - T 1750 A - G 528 C - T 937 A - G 1336 G - A 1755 T - C 531 A - G 958 T - C 1356 A - T 1756 A - G 533 C - G 963 A - G 1362 T - C 1758 T - C 538 G - A 970 G - T 1365 G - A 1814 C - A 552 G - A 990 A - C 1375 G - A 1821 T - C 555 G - A 991 G - A 1378 C - T - G 556 T - C 996 A - G 1379 T - C 590 G - A 999 G - A 1399 A - G 591 G - A 1009 A - G 1422 G - A
4.2.3. Kết quả so sánh trình tự amino acid của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
Kết quả so sánh trình tự amino acid mã hóa từ gene H và P của hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) được trình bày ở hình 4.15 và 4.16.
Kết quả ở hình 4.15 cho thấy hai chủng giống gốc có trình tự amino acid mã hóa từ gene H có độ dài là 607 amino acid. Trong khi đó, chủng virus vacxin Onderstepoort có độ dài trình tự amino acid mã hóa từ gene H ngắn hơn là 604 amino acid. Kết quả so sánh về trình tự amino acid giữa hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin cho thấy 57 vị trí sai khác (bảng 4.4). Trong đó:
- Chủng VNUA-CDV-03 có 57 vị trí sai khác so với chủng VNUA-CDV- 04 lần lượt ở các vị trí là: 21, 30, 47, 123, 146, 155, 156, 157, 159, 160, 162, 165, 171, 178, 180, 186, 197, 227, 238, 241, 245, 247, 277, 298, 303, 309, 313, 324, 330, 331, 337, 342, 344, 359, 365, 367, 376, 386, 401, 415, 417, 446, 459, 460, 467, 475, 500, 502, 506, 510, 517, 530, 549, 571, 572, 584, 586.
- Chủng VNUA-CDV-03 có 56 vị trí sai khác so với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) lần lượt ở các vị trí là: 21, 30, 47, 123, 146, 155, 156, 157, 159, 160, 162, 171, 178, 180, 186, 197, 227, 238, 241, 245, 247, 277, 298, 303, 309, 313, 324, 330, 331, 337, 342, 344, 359, 365, 367, 376, 386, 401, 415, 417, 446, 459, 460, 467, 475, 484, 500, 502, 506, 510, 517, 530, 549, 572, 584, 586.
- Chủng VNUA-CDV-04 có 3 vị trí sai khác so với chủng virus vacxin Onderstepoort (mã hiệu AF378705) lần lượt ở các vị trí là: 165, 484, 571.
Bên cạnh đó, kết quả so sánh về trình tự amino acid mã hóa từ từ gene H của hai chủng giống gốc đã chỉ ra một số vùng tập trung sai khác như 155-162, 313-344, 365-376, 530-531, 584-586. Những vị trí sai khác này có thể liên quan tới sự sai khác về đặc tính sinh học trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST của hai chủng giống gốc nghiên cứu và chủng virus vacxin Onderstepoort.
Kết quả đánh giá cấu trúc và thành phần amino acid mã hóa từ gene H của hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin đã cho thấy:
- Hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort đều có 12 Cysteine phân bố dọc trên chiều dài của protein mã hóa từ gene H lần lượt ở các vị trí: 139, 154, 188, 283, 296, 377, 382, 390, 490, 566, 575, 602. Kết quả nghiên
cứu này không có sự sai khác về số lượng và vị trí phân bố của Cysteine với nghiên cứu của Iwatsuki et al. (1997) và Lan et al. (2005c, 2006a, 2006b, 2007, 2009a). Điều này có thể được lý giải là do Cysteine là amino acid có tính bảo thủ, đóng vai trò rất quan trọng trong việc tạo cầu nối disulfide. Cầu nối disulfide là cần thiết cho sự ổn định cấu trúc của một số protein và có vai trò quan trọng đối với các hoạt động của protein (Mark et al., 1984; Wang et al., 1984; Giese et al., 1987; Pace et al., 1988; Matsumura et al., 1989). Việc cuộn gấp và trùng hợp các amino acid là điều kiện tiên quyết hình thành cấu trúc epitop kháng nguyên
và tương tác với kháng thể đơn dòng đặc hiệu dựa trên cầu nối disulfide (Hu et
al., 1994). Bên cạnh đó, các Cysteine ở các vị trí 287, 300, 381, 394, 494, 579 và 583 đóng vai trò rất quan trọng đối với cấu trúc kháng nguyên và quá trình tạo nên protein mã hóa từ gene H và tham gia vào các liên kết disulfide giữa các phân tử hoặc trong các phân tử ở measles virus (Hu and Norrby, 1994).
- Vùng kị nước chính của hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort dài 22 amino acid từ amino acid 35 tới 56, dài hơn so với chủng
virus Hamamatsu, Yanaka và Ueno (Iwatsuki et al., 1997). Chủng virus vacxin
Onderstepoort sử dụng trong nghiên cứu này có sự sai khác với chủng virus
vacxin trong nghiên cứu của Lan et al. (2006a) về vùng kị nước.
- Hai chủng giống gốc có số lượng vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine (N-glycosylation) lần lượt là: Chủng VNUA-CDV-03 có 9 vị trí là: 19-21, 149-151, 309-311, 391-393, 422-424, 456-458, 584-586, 587-589, 603- 605. Chủng VNUA-CDV-04 có 7 vị trí là: 19-21, 149-151, 391-393, 422-424, 456-458, 603-605. Chủng virus vacxin Onderstepoort có 6 vị trí là: 19-21, 149- 151, 391-393, 422-424, 456-458, 587-589. Hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort trong nghiên cứu này có sự sai khác với chủng vacxin
Onderstepoort (AAG30920) trong nghiên cứu Iwatsuki et al. (1997) và Hirama et
al. (2004) khi chỉ có 4 vị trí liên kết N-glycosylation. Bên cạnh đó, hai chủng giống gốc trong nghiên cứu này có số lượng vị trí glycosyl hóa liên kết với Asparagine tương đương với chủng P94S, Ac96I và S124C (Lan et al., 2007). Kết quả này cho thấy có sự sai khác về tính kháng nguyên giữa hai chủng giống gốc nghiên cứu và hai chủng này có sự sai khác với các chủng virus Care được phân lập và công bố trước đây, điều này do glycosyl hóa là một trong các cải