3.5.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
- Khôi phục tế bào
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tế bào (DMEM, 10% FBS được để trong tủ ấm 370C trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy)
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Ly tâm loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường đầy đủ.
Bước 4: Đưa vào nuôi cấy và theo dõi sự phát triển của tế bào. Giữ tế bào ở điều kiện 370C với 5% CO2; hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
- Cấy chuyển tế bào
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi cấy, rửa tế bào bằng dung dịch PBS (không chứa Ca2+hoặc Mg2+).
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin - EDTA. Ủ trong 5 đến 10 phút. Thêm 7ml môi trường nuôi cấy (không bổ sung FBS), trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin bằng cách rửa lại bằng PBS, ly tâm 1200 vòng/phút trong 5’ để loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn tế bào.
Bước 4: Hòa tan tế bào trong 6ml môi trường DMEM. Đếm tế bào bằng cách pha loãng tế bào 2 lần (10µl tế bào với 10µl môi trường nuôi cấy không bổ sung FBS), bổ sung thêm thuốc nhuộm Trypan blue 0,4%, sau đó dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, xác định số tế bào/ml.
Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2 x 105 tế bào/ml môi trường nuôi cấy có bổ sung FBS, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi cấy (6ml/bình T25, 15ml/ bình T75).
Bước 6: Nuôi tế bào ở 370C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
- Thu tế bào
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào chỉ khác ở bước 5 và bước 6.
Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5 x 106 tế bào/ml trong môi
trường nuôi cấy có bổ sung FBS và 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1ml/ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20oC trong 2 - 3
giờ, chuyển sang -80oC qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.
3.5.2. Phương pháp phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST
Bước 1: chuẩn bị tế bào phân lập: Tế bào Vero-DST được nuôi cấy trong môi trường và điều kiện thích hợp gồm môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung 5% FCS (Fetal calf serum), sau đó để trong
tủ ấm nuôi cấy tế bào (5% CO2) 30 phút trước khi gây nhiễm virus.
Bước 2: chuẩn bị mẫu virus phân lập: Mẫu virus được bảo quản ở -800C ly
tâm để loại bỏ DMSO. Sau đó hòa tan cặn trong DMEM và gây nhiễm vào tế bào Vero-DST.
Bước 3: gây nhiễm virus và quan sát kết quả: Từ các đĩa lồng tế bào đã chuẩn bị ở bước 1 hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung 100 µl mẫu virus đã
chuẩn bị ở bước 2. Tế bào gây nhiễm virus được ủ ở 370C với 5% CO2 trong 30
phút. Bổ sung 1,5 ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB (Tryptose Phosphate
Broth) vào đĩa lồng và để ở 370C với 5% CO2. Hàng ngày theo dõi sự phá hủy tế
bào bằng kính hiển vi soi nổi và thu virus khi tế bào bị phá hủy đạt 80% - 90% diện tích đáy của đĩa lồng.
3.5.3. Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml)
Chuẩn bị tế bào Vero-DST trên khay 96 giếng (2,0 x 104 tế bào/giếng). Loại
bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung huyễn dịch virus. Bổ sung vào mỗi giếng 25µl huyễn dịch virus được pha loãng theo cơ số 10, mỗi độ pha loãng cho vào 3 giếng. Sau khi ủ 1 giờ, môi trường duy trì DMEM (10% TBP) được bổ sung vào mỗi giếng (100 µl/giếng). Bệnh tích tế bào được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm. Giá trị TCID50/ml được xác định theo phương pháp của Reed and Muench (1938).
3.5.4. Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus
Chuẩn bị các khay 96 giếng nuôi cấy tế bào Vero-DST với số lượng đảm bảo 5×104 tế bào/giếng.
Virus Care được gây nhiễm lên tế bào với giá trị MOI là 0.01. Sau 1 giờ ủ, tiến hành rửa bằng 0,5 ml dung dịch PBS. Sau đó, bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100µl/giếng môi trường dinh dưỡng thiết yếu. Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong tế bào được thu riêng từ dịch nổi và phần tế bào còn lại ở các bình gây nhiễm tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ sau gây nhiễm virus.
Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus. Đường biểu biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log10 của TCID50 tại từng thời điểm thu virus.
3.5.5. Phương pháp RT-PCR
3.5.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Quy trình tách chiết RNA tổng số được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ Kit QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen, Hilden, Đức) với các bước thực hiện như sau:
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit. Bước 1: Hút 560μl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5ml.
Bước 2: Thêm 140μl dung dịch mẫu virus đã xử lý vào ống Eppendorf trên, sau đó đồng hóa trong 15 giây.
Bước 3: Ly tâm để lắng mẫu xuống đáy ống Eppendorf
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 5: Thêm 560 μl dung dịch Ethanol (96 - 100o), đồng hóa 15 giây và ly tâm để lắng mẫu nhằm loại bỏ các giọt trên nắp.
Bước 6: Chuyển 630μl huyễn dịch trên sang cột lọc QIAamp. Ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ dịch dưới.
Bước 7: Lặp lại bước 6 với phần dịch còn lại.
Bước 8: Thêm 500μl dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi giữ cột, bỏ nước dưới.
Bước 9: Thêm 500μl dung dịch AW2, ly tâm 14000 vòng/phút, trong 3 phút, giữ cột, bỏ nước dưới. Sau đó ly tâm 14000vòng/phút, trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn AW2.
Bước 10: Chuyển cột lọc sang một ống Eppendorf mới. Thêm 60μl dung dịch AVE để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút (để làm tan RNA trên màng xuống ống eppendorf mới). Sau đó ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới. Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20oC hoặc -800C.
3.5.5.2. Phương pháp RT-PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT-PCR theo bộ Kit Qiagen One-step RT-PCR với các thành phần cần cho một phản ứng như bảng 3.3. Bảng 3.3. Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Primer* 1,0
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Tổng thể tích 25,0
Ghi chú: Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR được trình bày ở bảng 3.2 tương ứng với gene H (CDVff1; CDV-HS2) và P (Upp1; Upp2) của virus Care.
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 50 60 giây Tổng hợp sợi mới 72 2 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
3.5.5.3. Phương pháp điện di
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Bản gel được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1,5 gram agarose với 100 ml dung
dịch đệm TBE 1X, sau đó đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong 5 phút. Đợi tới khi
thạch nguội (khoảng 500C – 600C) cho thêm 3µl Ethidium Bromide rồi đổ vào
khuôn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng kiểm tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3-5mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT-PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6µl DNA marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng các vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.5.6. Phương pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trình tự gene
Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu. Trong nghiên cứu này
chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) để phục vụ cho bước giải trình tự gene virus Care. Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gene tự động là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger.
Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau:
Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR:
Bước 1: Cho vào ống Eppendorf sản phẩm RT-PCR và dung dịch PB theo tỷ lệ 1:5 sau đó trộn đều.
Bước 2: Cho hỗn hợp đã trộn vào cột QIA đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút.
Bước 3: Cho 750μl PE vào cột QIA đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Bỏ dung dịch ở đáy ống. Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút.
Bước 4: Chuyển cột sang ống Eppendorf mới. Cho thêm 50 μl EB vào giữa màng để 1 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút (có thể lặp lại 1 lần nữa để đảm bảo lấy hết DNA).
Bước 5: Bỏ cột, lấy dung dịch ở ống Eppendorf (DNA tinh khiết).
Thực hiện phản ứng PCR sequence: Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml theo bảng 3.5.
Bảng 3.5. Thành phần và thể tích cho phản ứng PCR sequence
Thành phần Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
DTCS Quick Start Master Mix 8,0
Mẫu DNA 5,0
Primer* 0,2
dH2O 6,8
Tổng thể tích 20,0
Ghi chú: Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR sequence được trình bày ở bảng 3.2 tương ứng với gene H và P của virus Care.
Với chương trình chạy PCR sequence như bảng 3.6.
Bảng 3.6. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR sequence
Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ
Biến tính chuỗi DNA 960C 20 giây
30 chu kỳ
Gắn mồi 500C 20 giây
Kéo dài chuỗi DNA 600C 4 phút
Tinh sạch sản phẩm PCR sequence:
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter-Mỹ) Các bước tinh sạch sản phẩm như sau:
Bước 1: Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được hỗn hợp với 2 μl
Sodium acetate, 2 μl EDTA Na2 và 1 μl glycogen.
Bước 2: Bổ sung 60 μl cồn 1000 trong điều kiện lạnh và tiến hành ly tâm
14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi trên ống và giữ lại cặn DNA.
Bước 3: Bổ sung 200 μl cồn 750 lạnh, tiến hành ly tâm ở 14000 vòng/phút
trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn.
Bước 4: Lặp lại bước 3 và để DNA khô tự nhiên hoặc đặt trong máy quay khô chân không.
Bước 5: Bổ sung 40 μl SLS vào mỗi mẫu và trộn đều.
Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành giải trình tự.
Phân tích xác nhận chuỗi gene thu được bằng chương trình Blast trên ngân hàng gene (GenBank). Truy cập ngân hàng gene thu nhận và xác định tính tương đồng về nucleotide của các chuỗi gene tương ứng của virus với các phân đoạn gene thu được trong nghiên cứu. Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gene của chủng virus thu nhận bằng phần mềm Genetyx (version 5.0.4) và MEGA6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0). Sử dụng phương pháp test Maximum likehood với giá trị bootstrap là 1000 đơn vị. Các chủng tham chiếu sử dụng (phụ lục 1) để xây dựng cây sinh học phân tử được thu thập từ dữ liệu trên ngân hàng gene thế giới.
3.5.7. Phương pháp vô hoạt kháng nguyên virus
3.5.7.1. Vô hoạt bằng BEI
Tiến hành vô hoạt kháng nguyên virus bằng cách bổ sung dung dịch BEI vào dịch nổi virus để thu được nồng độ BEI cuối cùng là 0,005M – 0,01M. Ủ ở
370C trong 24 - 72 giờ. Sau đó, trung hòa BEI bằng dung dịch Natri thiosulfat
(Na2S2O3) 50%. Kiểm tra kết quả quá trình vô hoạt kháng nguyên virus bằng cách gây nhiễm 200µl hỗn dịch kháng nguyên sau khi vô hoạt trên môi trường tế bào Vero-DST bình thường với 3 - 5 giếng ở khay 24 giếng và quan sát bệnh tích sau 72 giờ nuôi cấy. Hỗn dịch kháng nguyên sau khi vô hoạt đạt yêu cầu khi không gây bệnh tích tế bào và không gây chết tế bào.
3.5.7.2. Trộn chất bổ trợ
- Trộn đều hỗn dịch kháng nguyên virus sau khi vô hoạt với chất bổ trợ là dầu khoáng ISA 740 với tỷ lệ 1:1 (1 phần dịch chứa kháng nguyên virus, 1 phần dầu khoáng). Khuấy nhũ dầu với tốc độ 8.000 vòng/phút trong 2 phút sau đó bổ sung từ từ hỗn dịch kháng nguyên vào và khuấy trong 8 phút.
- Sau khi trộn chất bổ trợ, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu: Kiểm tra pH,
kiểm tra độ đồng nhất, kiểm tra độ nhớt. Sau đó bảo quản ở 40C.
3.5.7.3. Tiêm cho chó thí nghiệm
Hỗn dịch kháng nguyên virus vô hoạt bổ sung chất bổ trợ được tiêm bắp cho chó thí nghiệm với liều 2ml/con. Ở lô đối chứng sử dụng nước cất để tiêm cho chó thí nghiệm. Bảng 3.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Các chỉ tiêu Lô thí nghiệm chủng VNUA- CDV-03 Lô thí nghiệm chủng VNUA- CDV-04 Lô đối chứng Số lượng chó (con) 5 5 5
Mua về, nuôi và theo dõi 14 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm
Tiêm hỗn dịch kháng nguyên virus vô hoạt bổ
sung chất bổ trợ 2ml/con. Kháng nguyên virus chủng VNUA-CDV-03 2ml/con. Kháng nguyên virus chủng VNUA-CDV-04 2ml/con. Nước cất Thời gian theo dõi sau
khi tiêm hỗn dịch kháng nguyên virus Care vô hoạt bổ sung chất bổ trợ
56 ngày
3.5.8. Phương pháp ELISA
Mẫu máu chó thí nghiệm được lấy ở các thời điểm -14, -7, 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56; sau đó được xác định kháng thể bằng bộ kit ELISA Ingezime MOQUILLO IgG 1.5.CDG.K1 của hãng Ingenasa (Tây Ban Nha). Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả phản ứng ELISA được đọc ở bước sóng 450nm.
Đọc kết quả:
+ Giá trị Cut off = giá trị OD đối chứng dương x 0,2 + Mẫu âm tính: giá trị OD ≤ giá trị Cut off
3.5.9. Xử lý số liệu
Những số liệu kết quả thu được trong nghiên cứu sẽ được xử lý bằng phần mềm thống kê sinh học GraphPad Prism (version 6). Phần mềm sẽ tính toán các giá trị trung bình (Mean) và độ lệch chuẩn (SD). Sử dụng phương pháp phân tích thống kê phân tích phương sai (ANOVA/Two way) nhằm chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các số liệu thu thập được.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE
4.1.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
Hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 nghiên cứu đã được phân lập từ chó mắc bệnh Care ngoài thực địa. Hai chủng giống gốc này
đang ở đời cấy truyền P#5 và được bảo quản ở điều kiện -800C. Trong nghiên
cứu này, nhằm đánh giá được khả năng gây bệnh tích tế bào và nhân lên của