PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.5. Phương pháp RT-PCR
3.5.5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Quy trình tách chiết RNA tổng số được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ Kit QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen, Hilden, Đức) với các bước thực hiện như sau:
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit. Bước 1: Hút 560μl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5ml.
Bước 2: Thêm 140μl dung dịch mẫu virus đã xử lý vào ống Eppendorf trên, sau đó đồng hóa trong 15 giây.
Bước 3: Ly tâm để lắng mẫu xuống đáy ống Eppendorf
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 5: Thêm 560 μl dung dịch Ethanol (96 - 100o), đồng hóa 15 giây và ly tâm để lắng mẫu nhằm loại bỏ các giọt trên nắp.
Bước 6: Chuyển 630μl huyễn dịch trên sang cột lọc QIAamp. Ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ dịch dưới.
Bước 7: Lặp lại bước 6 với phần dịch còn lại.
Bước 8: Thêm 500μl dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi giữ cột, bỏ nước dưới.
Bước 9: Thêm 500μl dung dịch AW2, ly tâm 14000 vòng/phút, trong 3 phút, giữ cột, bỏ nước dưới. Sau đó ly tâm 14000vòng/phút, trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn AW2.
Bước 10: Chuyển cột lọc sang một ống Eppendorf mới. Thêm 60μl dung dịch AVE để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút (để làm tan RNA trên màng xuống ống eppendorf mới). Sau đó ly tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới. Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20oC hoặc -800C.
3.5.5.2. Phương pháp RT-PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT-PCR theo bộ Kit Qiagen One-step RT-PCR với các thành phần cần cho một phản ứng như bảng 3.3. Bảng 3.3. Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (μl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Primer* 1,0
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Tổng thể tích 25,0
Ghi chú: Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR được trình bày ở bảng 3.2 tương ứng với gene H (CDVff1; CDV-HS2) và P (Upp1; Upp2) của virus Care.
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 45 45 phút 1 Duỗi mạch 95 2 phút 2 Duỗi mạch 95 30 giây 35 Gắn mồi 50 60 giây Tổng hợp sợi mới 72 2 phút 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
3.5.5.3. Phương pháp điện di
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Bản gel được chuẩn bị bằng cách hòa tan 1,5 gram agarose với 100 ml dung
dịch đệm TBE 1X, sau đó đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong 5 phút. Đợi tới khi
thạch nguội (khoảng 500C – 600C) cho thêm 3µl Ethidium Bromide rồi đổ vào
khuôn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng kiểm tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3-5mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT-PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6µl DNA marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng các vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.