Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Số chu kỳ
Biến tính chuỗi DNA 960C 20 giây
30 chu kỳ
Gắn mồi 500C 20 giây
Kéo dài chuỗi DNA 600C 4 phút
Tinh sạch sản phẩm PCR sequence:
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter-Mỹ) Các bước tinh sạch sản phẩm như sau:
Bước 1: Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được hỗn hợp với 2 μl
Sodium acetate, 2 μl EDTA Na2 và 1 μl glycogen.
Bước 2: Bổ sung 60 μl cồn 1000 trong điều kiện lạnh và tiến hành ly tâm
14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi trên ống và giữ lại cặn DNA.
Bước 3: Bổ sung 200 μl cồn 750 lạnh, tiến hành ly tâm ở 14000 vòng/phút
trong 2 phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn.
Bước 4: Lặp lại bước 3 và để DNA khô tự nhiên hoặc đặt trong máy quay khô chân không.
Bước 5: Bổ sung 40 μl SLS vào mỗi mẫu và trộn đều.
Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành giải trình tự.
Phân tích xác nhận chuỗi gene thu được bằng chương trình Blast trên ngân hàng gene (GenBank). Truy cập ngân hàng gene thu nhận và xác định tính tương đồng về nucleotide của các chuỗi gene tương ứng của virus với các phân đoạn gene thu được trong nghiên cứu. Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gene của chủng virus thu nhận bằng phần mềm Genetyx (version 5.0.4) và MEGA6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0). Sử dụng phương pháp test Maximum likehood với giá trị bootstrap là 1000 đơn vị. Các chủng tham chiếu sử dụng (phụ lục 1) để xây dựng cây sinh học phân tử được thu thập từ dữ liệu trên ngân hàng gene thế giới.
3.5.7. Phương pháp vô hoạt kháng nguyên virus
3.5.7.1. Vô hoạt bằng BEI
Tiến hành vô hoạt kháng nguyên virus bằng cách bổ sung dung dịch BEI vào dịch nổi virus để thu được nồng độ BEI cuối cùng là 0,005M – 0,01M. Ủ ở
370C trong 24 - 72 giờ. Sau đó, trung hòa BEI bằng dung dịch Natri thiosulfat
(Na2S2O3) 50%. Kiểm tra kết quả quá trình vô hoạt kháng nguyên virus bằng cách gây nhiễm 200µl hỗn dịch kháng nguyên sau khi vô hoạt trên môi trường tế bào Vero-DST bình thường với 3 - 5 giếng ở khay 24 giếng và quan sát bệnh tích sau 72 giờ nuôi cấy. Hỗn dịch kháng nguyên sau khi vô hoạt đạt yêu cầu khi không gây bệnh tích tế bào và không gây chết tế bào.
3.5.7.2. Trộn chất bổ trợ
- Trộn đều hỗn dịch kháng nguyên virus sau khi vô hoạt với chất bổ trợ là dầu khoáng ISA 740 với tỷ lệ 1:1 (1 phần dịch chứa kháng nguyên virus, 1 phần dầu khoáng). Khuấy nhũ dầu với tốc độ 8.000 vòng/phút trong 2 phút sau đó bổ sung từ từ hỗn dịch kháng nguyên vào và khuấy trong 8 phút.
- Sau khi trộn chất bổ trợ, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu: Kiểm tra pH,
kiểm tra độ đồng nhất, kiểm tra độ nhớt. Sau đó bảo quản ở 40C.
3.5.7.3. Tiêm cho chó thí nghiệm
Hỗn dịch kháng nguyên virus vô hoạt bổ sung chất bổ trợ được tiêm bắp cho chó thí nghiệm với liều 2ml/con. Ở lô đối chứng sử dụng nước cất để tiêm cho chó thí nghiệm. Bảng 3.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Các chỉ tiêu Lô thí nghiệm chủng VNUA- CDV-03 Lô thí nghiệm chủng VNUA- CDV-04 Lô đối chứng Số lượng chó (con) 5 5 5
Mua về, nuôi và theo dõi 14 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm
Tiêm hỗn dịch kháng nguyên virus vô hoạt bổ
sung chất bổ trợ 2ml/con. Kháng nguyên virus chủng VNUA-CDV-03 2ml/con. Kháng nguyên virus chủng VNUA-CDV-04 2ml/con. Nước cất Thời gian theo dõi sau
khi tiêm hỗn dịch kháng nguyên virus Care vô hoạt bổ sung chất bổ trợ
56 ngày
3.5.8. Phương pháp ELISA
Mẫu máu chó thí nghiệm được lấy ở các thời điểm -14, -7, 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56; sau đó được xác định kháng thể bằng bộ kit ELISA Ingezime MOQUILLO IgG 1.5.CDG.K1 của hãng Ingenasa (Tây Ban Nha). Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả phản ứng ELISA được đọc ở bước sóng 450nm.
Đọc kết quả:
+ Giá trị Cut off = giá trị OD đối chứng dương x 0,2 + Mẫu âm tính: giá trị OD ≤ giá trị Cut off
3.5.9. Xử lý số liệu
Những số liệu kết quả thu được trong nghiên cứu sẽ được xử lý bằng phần mềm thống kê sinh học GraphPad Prism (version 6). Phần mềm sẽ tính toán các giá trị trung bình (Mean) và độ lệch chuẩn (SD). Sử dụng phương pháp phân tích thống kê phân tích phương sai (ANOVA/Two way) nhằm chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê của các số liệu thu thập được.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG NHỮNG CHỦNG GIỐNG GỐC SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH CARE
4.1.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
Hai chủng giống gốc VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 nghiên cứu đã được phân lập từ chó mắc bệnh Care ngoài thực địa. Hai chủng giống gốc này
đang ở đời cấy truyền P#5 và được bảo quản ở điều kiện -800C. Trong nghiên
cứu này, nhằm đánh giá được khả năng gây bệnh tích tế bào và nhân lên của virus trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST, nghiên cứu đã sử dụng chủng virus vacxin Onderstepoort được phân lập từ vacxin thương mại để so sánh với hai chủng giống gốc nghiên cứu. Kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào của hai chủng giống gốc nghiên cứu và chủng virus vacxin được thể hiện ở hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào của hai chủng giống gốc nghiên cứu và chủng virus vacxin Onderstepoort
Ghi chú:
B: Tế bào bong chóc hoàn toàn khỏi bề mặt nuôi cấy; CPE: bệnh tích tế bào (%). *: Sai khác có ý nghĩa thống kê giữa chủng virus vacxin Onderstepoort và các chủng giống gốc nghiên cứu, với giá trị P < 0,05.
****: Sai khác có ý nghĩa thống kê giữa chủng virus vacxin Onderstepoort và các chủng giống gốc nghiên cứu, với giá trị P < 0,0001.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng giống gốc nghiên cứu có khả năng gây bệnh tích tế bào tương đối giống nhau nhưng có sự sai khác với chủng virus vacxin Onderstepoort. Khi xem xét tại các thời điểm khác nhau sau khi gây nhiễm hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort nhận thấy có sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Sau 12 giờ gây nhiễm, chủng virus VNUA-CDV- 04 có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với chủng virus VNUA-CDV-03 và chủng virus vacxin Onderstepoort. Thời điểm sau 24, 36 và 48 giờ sau khi gây nhiễm, hai chủng giống gốc không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với nhau, hai chủng giống gốc có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với chủng virus vacxin Onderstepoort. Sau 60 và 72 giờ gây nhiễm, do chủng virus vacxin Onderstepoort đã phá huỷ và làm bong chóc toàn bộ tế bào khỏi bề mặt nuôi cấy nên không thể so sánh được về sự sai khác với hai chủng giống gốc nghiên cứu.
Chủng virus VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 bắt đầu gây bệnh tích tế bào sau 12 giờ gây nhiễm, phá hủy 50-55% tế bào nuôi cấy sau 36 giờ gây nhiễm (hình 4.2 và 4.3), bệnh tích tế bào đạt 90% sau 48 giờ gây nhiễm (hình 4.4 và 4.5) và phá hủy toàn bộ tế bào (CPE là 100%) sau 60-72 giờ gây nhiễm (hình 4.6 và 4.7). Trong khi đó, chủng virus vacxin Onderstepoort xuất hiện bệnh tích tế bào sau 12 giờ gây nhiễm, bệnh tích tế bào đạt 50% sau 24 giờ gây nhiễm, bệnh tích tế bào đạt 90% sau 36 giờ gây nhiễm và bệnh tích tế bào đạt 100% sau 48 giờ gây nhiễm. Kết quả so sánh cho thấy chủng virus vacxin có thời gian phá hủy tế bào nhanh hơn so với hai chủng giống gốc nghiên cứu, điều này có thể được lý giải là do chủng virus vacxin đã được thuần hóa và nuôi cấy nhiều đời trên môi trường nuôi cấy nhân tạo nên có khả năng thích ứng nhanh hơn so với các chủng virus được phân lập từ thực địa. Khi so sánh về nguồn gốc mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập của hai chủng giống gốc nghiên cứu nhận thấy không có sự sai khác về khả năng gây bệnh tích tế bào trên môi trường nuôi cấy dòng tế bào Vero- DST. Điều này có thể do dòng tế bào Vero-DST phù hợp để phân lập virus Care
từ các mẫu bệnh phẩm của chó bệnh (Seki et al., 2003).
Bệnh tích tế bào quan sát được sau thời gian gây nhiễm hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort là kiểu syncytium - thể hợp bào với biểu hiện là các tế bào co cụm lại, màng tế bào bị tan rã, các nhân tế bào co cụm lại, tế bào không bám được vào đáy bình nuôi cấy, sau đó tế bào bị phá hủy và bong tróc khỏi bề mặt đáy bình nuôi cấy. Khi so sánh với khả năng gây bệnh tích tế bào của hai chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 với chủng virus CDV-HN1,
Vn86 và Vn99 đã được phân lập tại Việt Nam năm 2008 (Lan et al., 2008,
2009a) và XJ2 tại Trung Quốc năm 2010 (Qiao et al., 2010), kết quả cho thấy
hai chủng giống gốc nghiên cứu gây bệnh tích tế bào kiểu hợp bào giống với 4 chủng virus trên. Tuy nhiên thời gian để hai chủng giống gốc phá hủy 90-95% tế bào là chậm hơn so với hai chủng Vn86 và Vn99 (CPE đạt 90-95% sau 24 giờ gây nhiễm) nhưng nhanh hơn so với chủng XJ2 (thể hợp bào xuất hiện sau 72 giờ gây nhiễm).
Một số hình ảnh bệnh tích tế bào do hai chủng giống gốc gây ra trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST
Hình 4.2. CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 4.3. CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 36 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 4.4. CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 4.5. CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 48 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 4.6. CPE do VNUA-CDV-03 gây ra sau 60 giờ gây nhiễm (10X)
Hình 4.7. CPE do VNUA-CDV-04 gây ra sau 60 giờ gây nhiễm (10X) 4.1.2. Hiệu giá của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
Bên cạnh việc đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào, nghiên cứu đã tiến hành xác định hiệu giá virus của hai chủng virus VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04. Kết quả xác định hiệu giá virus được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Hiệu giá của những chủng virus Care sử dụng trong nghiên cứu
STT Chủng virus Hiệu giá virus
(TCID50/25µl)
1 VNUA-CDV-03 3,16 x 104
2 VNUA-CDV-04 1,47 x 104
3 Onderstepoort 6,67 x 104
Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy hai chủng giống gốc có hiệu giá virus tương đối cao. Hiệu giá virus của hai chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 thấp hơn so với các chủng virus Care phân lập được tại Việt Nam trước đây như
CDV-HN1 (3.16 x 105 TCID50/25ul) (Lan et al., 2008), Vn86 và Vn99 (Lan et
al., 2009a). Khi so sánh về nguồn gốc các mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập virus, nhận thấy 3 chủng virus CDV-HN1, Vn86 và Vn99 được phân lập từ phổi, não và hạch phổi có hiệu giá virus cao hơn so với hai chủng giống gốc được phân lập từ ruột và phổi. Điều này góp phần làm sáng tỏ các cơ quan đích tấn công, phân bố và tập trung của virus Care trong cơ thể chó bệnh và sự phân bố này là không đồng đều nhau.
4.1.3. Kết quả xác định quy luật nhân lên của những chủng giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt phòng bệnh Care
Trong nghiên cứu đặc tính sinh học của virus thì việc xác định được quy luật nhân lên của virus trên môi trường nuôi cấy là vô cùng quan trọng, điều này giúp cho các nhà nghiên cứu xác định được tương đối chính xác các pha trong quá trình nhân lên của virus. Kết quả xây dựng đường biểu diễn quy luật nhân lên của hai chủng giống gốc nghiên cứu so với chủng virus vacxin Onderstepoort được trình bày ở hình 4.8 và 4.9.
Kết quả nghiên cứu quy luật cho thấy hai chủng giống gốc nghiên cứu có quy luật nhân lên sai khác với chủng virus vacxin Onderstepoort tại các thời điểm thu hoạch virus khác nhau sau khi gây nhiễm. Trong đó, thời điểm 24, 36 và 48 giờ sau khi gây nhiễm, hai chủng giống gốc có pha nhân lên trong tế bào sai khác với chủng virus vacxin Onderstepoort có ý nghĩa thống kê. Đối với pha giải phóng tự do ngoài môi trường nuôi cấy thì chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 có sự sai khác có ý nghĩa thống kê với chủng virus vacxin Onderstepoort lần lượt ở các giai đoạn 48 giờ và 24-36 giờ sau gây nhiễm. Khi xem xét ở từng chủng giống gốc nghiên cứu, nhận thấy có sự sai khác về pha nhân lên trong tế bào và giải phóng tự do ngoài môi trường nuôi cấy tương ứng với chủng VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 lần lượt ở thời điểm 60 giờ và 24 giờ và 48-72 giờ sau khi gây nhiễm. Như vậy, sự tăng trưởng của virus trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero-DST không phải là một quá trình liên tục, đồng đều. Cả hai chủng giống gốc và chủng virus vacxin Onderstepoort đều có pha tấn công, xâm nhập và nhân lên trong tế bào mạnh hay yếu tùy từng thời điểm nhất định.
Chủng VNUA-CDV-03 xâm nhập và nhân lên nhanh trong tế bào Vero- DST sau 24 giờ gây nhiễm, đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm (3,16 x 104 TCID50/25µl), sau đó hàm lượng virus giảm sau 60 giờ gây nhiễm (1,0 x 104
TCID50/25µl). Trong khi đó, hàm lượng virus giải phóng tự do ngoài môi trường
nuôi cấy tăng mạnh sau 24 giờ gây nhiễm, đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm
(1,45 x 104 TCID50/25µl), sau đó hàm lượng virus giảm dần ở thời điểm 60 - 72
giờ sau khi gây nhiễm.
Chủng VNUA-CDV-04 xâm nhập và nhân lên nhanh trong tế bào Vero- DST sau 24 giờ gây nhiễm, đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm (1,45 x 104
TCID50/25µl), hàm lượng virus giảm sau 60 giờ gây nhiễm (3,16 x 103
TCID50/25µl). Trong khi đó, hàm lượng virus giải phóng tự do ngoài môi trường
nuôi cấy tăng mạnh sau 24 giờ gây nhiễm, đạt cực đại sau 48 giờ gây nhiễm
(3,16 x 103 TCID50/25µl), sau đó hàm lượng virus giảm dần ở thời điểm 60 - 72
giờ sau khi gây nhiễm.
Khi so sánh về quy luật nhân lên giữa hai chủng giống gốc virus Care với chủng virus vacxin Onderstepoory nhận thấy 3 chủng virus có đặc điểm chung là pha nhân lên trong tế bào luôn chiếm ưu thế với hàm lượng virus tập trung trong tế bào luôn cao hơn hàm lượng virus tập trung ở ngoài tế bào tại các thời điểm thu hoạch virus khác nhau. Hàm lượng virus nhân lên trong tế bào đạt cực đại tại thời điểm 36 - 48 giờ sau khi gây nhiễm, sau đó hàm lượng virus giảm. Có sự sai khác tại thời điểm hàm lượng virus giảm giữa hai chủng virus VNUA-CDV-03 và VNUA-CDV-04 và chủng virus vacxin Onderstepoort. Kết quả này có ý nghĩa vô cùng quan trọng giúp xác định được thời điểm thích hợp để thu hoạch virus đạt hiệu giá cao nhất.
Quy luật nhân lên của hai chủng giống gốc nghiên cứu có sự sai khác với các chủng virus 007Lm (genotype Asia 2), chủng S124C (genotype Asia 1) và
Vn86 (genotype Classic) được phân lập trước đây trong những nghiên cứu Lan et
al. (2006b, 2009a) về hiệu giá virus và thời điểm đạt cực đại ở pha nhân lên trong tế bào và giải phóng tự do ngoài tế bào. Trong đó, chủng 007Lm có hàm lượng virus trong tế bào và giải phóng tự do ngoài môi trường đạt cực đại tại thời điểm