Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp thu thập mẫu
Các mẫu phân và huyết thanh chó được thu thập theo phương pháp ngẫu nhiên đơn giản, tại các thời điểm khác nhau từ các ca chó tới khám tại phòng khám GAIA và lò mổ ở tỉnh Bắc Ninh.
Lấy 10 – 20g phân, cho vào túi zip đã chuẩn bị sẵn, ghi đầy đủ các thông tin cần thiết: Số thứ tự mẫu, số ID, thời gian lấy mẫu, tình trạng phân,... Mẫu phân thu thập xong đưa về phòng thí nghiệm và được xử lý ngay trong ngày.
Lấy 3ml máu, cho vào ống đựng máu, ghi số ID.
Mẫu phân và huyết thanh để thiết lập phản ứng ELISA được lấy từ cùng một đối tượng, cùng một thời điểm.
3.5.2. Phương pháp định danh bằng hình thái học
Phân loài giun dựa vào một số đặc điểm hình thái, cấu tạo và kích thước của trứng giun tròn theo khóa định loại của M.A. Taylor, (2016) định loại trứng giun tròn theo khóa định loại của Mönnig (Trịnh Văn Thịnh, 1963).
3.5.3. Phương pháp phù nổi Willis
Xét nghiệm phân tìm trứng giun tròn bằng phương pháp Willis. Phương pháp này dùng để xác định trứng giun tròn từ các mẫu phân thu được. Lấy 2g
phân cần xét nghiệm cho vào cốc sạch, cho 28ml nước muối bão hòa vào cốc, dùng đũa thủy tinh khuấy tan sau đó lọc qua lưới thép bỏ cặn. Lấy dung dịch vừa lọc được cho vào ống đầy fancol 15ml, đậy lamen, để yên tĩnh 20-30 phút. Sau đó chuyển lamen lên phiến kính sạch, quan sát dưới kính hiển vi để xác định trứng giun.
3.5.4. Phương pháp điều chế kháng nguyên thân
Giun trưởng thành sau khi thu thập được rửa 2-3 lần bằng dung dịch PBS 1X để làm sạch giun. Cho toàn bộ giun thu được vào ống Eppendorf có sẵn dung dịch PBS, nghiền nát giun bằng chày nhựa, bổ sung thêm dung dịch PBS tới 0.6 ml. Sau đó đem ly tâm lạnh 12.000 vòng/ 30 phút thu lấy dịch nổi, bảo quản -200C.
3.5.5. Phương pháp điều chế kháng nguyên chất tiết
Rửa 2-3 lần giun trưởng thành trong dung dịch PBS 1X, cho toàn bộ giun thu được vào ống eppendorf có sẵn dung dịch PBS 1X, nuôi giun trong tủ ấm 370C, qua đêm. Sau đó, tách toàn bộ dung dịch sang ống eppendorf mới, ly tâm lạnh 12.000 vòng/30 phút, thu lấy dịch nổi. Bảo quản kháng nguyên ở -200C.
3.5.6. Phương pháp điện di SDS- PAGE
Biến tính mẫu ở nhiệt độ 95-100⁰C trong vòng 5 phút cùng với dung dịch nạp mẫu, sau đó nhỏ mẫu vào các giếng trên bản gel (gồm stacking gel và 12% separating gel). Quá trình điện di được tiến hành ở hiệu điện thế 80V trong 40 phút, sau đó chạy điện di ở điện thế 120V trong 65 phút. Gel được nhuộm bằng Coomassie Blue. Tiến hành giải nhuộm và đọc kết quả.
3.5.7. Phương pháp thẩm tách miễn dịch Western Blot sử dụng màng
Polyvinylidene Fluoride (PVDF)
Sau khi phân tách các thành phần protein trong mẫu bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, protein tiếp tục được chuyển sang màng lai PVDF. Ủ màng lai với dung dịch blocking (3% skim milk trong TBS-T) ủ qua đêm ở 4⁰C. Rửa 2 lần bằng TBS-T, mỗi lần 15 phút. Thêm Kháng thể sơ cấp (huyết thanh chó nhiễm bệnh) pha loãng với tỷ lệ 1:100, ủ trong 90 phút. Rửa màng 3 lần bằng TBS-T, mỗi lần 15 phút. Ủ với kháng thể thứ cấp (kháng kháng thể của chó) có chứa enzyme HPR (Goat anti-canine IgG, ThermoFisher Scientific, US) pha loãng với tỷ lệ 1:1000 ủ trong 90 phút ở nhiệt độ phòng và rửa màng 3 lần bằng
TBS-T, mỗi lần 15 phút. Sử dụng 4C1N và H2O2 ủ màng trong 1-2 phút, quan sát các vạch band trên màng và đọc kết quả.
3.5.8. Phương pháp ELISA
Chuẩn bị dung dịch rửa: 0,005% Tween-20 trong PBS 1X (PBS-T)
- Bước 1: Pha loãng kháng nguyên với tỷ lệ 1/10 bằng dung dịch coating buffer, mỗi giếng nhỏ 100µl. Ủ qua đêm ở 4ºC
- Bước 2: Nhỏ vào các giếng mỗi giếng 300µl blocking buffer (0.05% skim milk trong PBS-T), ủ trong vòng 1 giờ ở nhiệt độ 37ºC.
- Bước 3: Pha loãng kháng thể ở tỉ lệ 1/100 với dung dịch PBS-T. Mỗi giếng nhỏ 100µl, ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ 37ºC.
- Bước 4: Rửa 3 lần bằng PBS-T.
- Bước 5: Pha loãng kháng thể ở nồng độ 1/10 000, nhỏ 100µl vào từng giếng. Ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ 37ºC.
- Bước 6: Rửa 3 lần bằng PBS-T.
- Bước 7: Nhỏ 100µl cơ chất (TMB + H2O2 3%) vào từng giếng. Ủ tối trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
- Bước 8: Sử dụng H2SO4 2M để dừng phản ứng. Nhỏ 100µl vào mỗi giếng, sau đó đưa đĩa ELISA vào máy đọc kết quả.
3.5.9. Lựa chọn nồng độ kháng nguyên, độ pha loãng kháng thể.
Kháng nguyên thân của giun móc chó (SA) là một hỗn hợp các thành phần protein có trong thân của giun móc trưởng thành, là những chất có tác động mạnh mẽ đến các phản ứng miễn dịch trong cơ thể của vật chủ và đó là các yếu tố quan trọng liên quan đến sự sống sót của giun, duy trì quá trình nhiễm bệnh mãn tính ở vật chủ. Đối với giun móc, nhiều thành phần protein có trong kháng nguyên chất tiết đã được công bố, tuy nhiên về tác dụng của chúng trong các phản ứng miễn dịch vẫn chưa được xác định rõ và đang là xu hướng nghiên cứu nổi bật đối với các nhà nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam.
Kháng nguyên thân của giun móc có nồng độ protein rất cao nên việc xác định được nồng độ pha loãng của kháng nguyên trong các phản ứng miễn dịch là vô cùng quan trọng trong việc thiết kế thí nghiệm với độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
Theo Celia Maxwell et al.,1987 chỉ với một lượng nhỏ ấu trùng giun móc khi xâm nhập vào cơ thể cũng ngay lập tức có thể khiến một lượng lớn kháng thể được sinh ra, bằng phản ứng ELISA có thể xác định được lượng kháng thể trong cơ thể vật chủ ở thời gian đầu của quá trình xâm nhiễm. Vì vậy, việc sử dụng phương pháp ELISA là cần thiết để chẩn đoán và phát hiện chính xác bệnh giun móc chó trong những giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm.
Bố trí thí nghiệm
Thiết lập phản ứng ELISA để tìm ra nồng độ pha loãng kháng nguyên và kháng thể thích hợp. Để chọn được nồng độ tối ưu, tiến hành pha loãng kháng nguyên và kháng thể ở các nồng độ khác nhau cụ thể như sau: Kháng nguyên được pha loãng ở vị trí đầu tiên trên đĩa ELISA và tiếp tục được pha loãng ở các tỉ lệ tiếp theo theo hàng ngang, bắt đầu 0,3 µg/ml Theo chiều dọc đến 7,32*10-6 µg/ml ,Huyết thanh âm tính (-) được nhỏ từ ô A tới ô D, huyết thanh dương tính (+) được nhỏ từ ô E tới ô dưới cùng với tỉ lệ là 1/100, 1/200, 1/400, 1/800.
3.5.10. Phương pháp xác định giá trị ngưỡng
Giá trị ngưỡng là giá trị quyết định kết quả dương tính hay âm tính và được tính theo công thức sau:
Giá trị ngưỡng = (giá trị trùng bình + 3 x độ lệch chuẩn) (Kumar and Rao, 1991). Bố trí thí nghiệm
Để tìm ra giá trị ngưỡng (cut-off) và xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng ELISA, chúng tôi lựa chọn 40 mẫu huyết thanh chó được thu tại một số lò mổ trong đó có 20 mẫu kháng thể âm và 20 mẫu kháng thể dương và tiến hành phản ứng ELISA sử dụng nồng độ kháng nguyên 0,005 µg/ml, nồng độ pha loãng kháng thể 1/800
3.5.11. Phương pháp tính độ nhạy và độ đặc hiệu
Độ nhạy của một xét nghiệm là tỷ lệ những trường hợp thực sự có bệnh và có kết quả xét nghiệm dương tính trong toàn bộ các trường hợp có bệnh, cùng với độ nhạy là độ đặc hiệu. Độ đặc hiệu của một xét nghiệm là tỷ lệ những trường hợp thực sự không có bệnh và có kết quả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ các trường hợp không bị bệnh. Phân tích thống kê để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu giữa phương pháp ELISA và phương pháp xét nghiệm phân được thực
hiện theo công thức thống kê do Samad et al.(1994) đưa ra. Công thức thống kê được sử dụng như sau:
Bảng 3.1. Công thức thống kê
Xét nghiệm chuẩn (Xét nghiệm tìm trứng trong phân)
Tổng
Có bệnh Không có bệnh
ELISA Dương tính a b a+b
Âm tính c d c+d
Tổng a+c b+d a+b+c+d=N
Trong đó:
a: Số mẫu dương tính với cả 2 phương pháp.
b: Số mẫu dương tính với phương pháp ELISA nhưng âm tính với xét nghiệm chuẩn.
c: Số mẫu âm tính với phương pháp ELISA nhưng dương tính với xét nghiệm chuẩn.
d: Số mẫu âm tính với cả hai phương pháp.
a+b: Tổng số trường hợp có kết quả dương tính với phương pháp xét nghiệm chuẩn.
c+d: Tổng số trường hợp có kết quả âm tính với phương pháp xét nghiệm chuẩn.
a+c: Tổng số trường hợp có kết quả dương tính với phương pháp xét nghiệm ELISA.
b+d: Tổng số trường hợp có kết quả dương tính với phương pháp xét nghiệm ELISA.
a+b+c+d: Tổng số mẫu
- Độ nhạy được tính theo công thức sau
Độ nhạy = Số mẫu dương tính với cả hai phương pháp/Tổng số trường hợp có kết quả dương tính với phương pháp xét nghiệm ELISA
- Độ đặc hiệu được tính theo công thức sau:
Độ đặc hiệu = Số mẫu âm tính với cả hai phương pháp/Tổng số trường hợp có kết quả âm tính với phương pháp xét nghiệm ELISA
Bố trí thí nghiệm
Tiến hành kiểm tra mẫu phân của 40 mẫu phân thu từ 40 cá thể chó có huyết thanh được sử dụng trong quá trình tính giá trị ngưỡng từ đó so sánh kết quả chẩn đoán giữa xét nghiệm phân và chẩn đoán bằng ELISA để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng ELISA.
3.5.12. Phương pháp xử lý thống kê sinh học
Toàn bộ số liệu của báo cáo thống kê sinh học được xử lý bằng phần mềm Excel 2013.
3.5.13. Sơ đồ nghiên cứu
Chó
Phân Giun trưởng
thành Huyết thanh Soi phân tìm trứng giun móc bằng phương pháp Willis Định danh hình bằng hình thái học Điều chế kháng nguyên Điện di SDS-Page Western Blot Thiết lập phản ứng ELISA