Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Kết quả điều tra tại phòng khám và chăm sóc thú cưng gaia
CƯNG GAIA
4.1.1. Tình hình nhiễm giun móc ở chó tại Phòng khám và chăm sóc Thú cưng GAIA cưng GAIA
Tiến hành xét nghiệm 180 mẫu phân chó thu thập được tại phòng khám thú y Gaia, kết quả thấy trong 180 kiểm tra thì có 47 mẫu dương tính với giun móc chó, chiếm 26,11% .
Tỷ lệ nhiễm giun móc chó vẫn còn khá cao tại phòng khám có thể do tập quán nuôi chó của người dân vẫn theo hình thức thả rông hoặc bán thả rông nên chó có nhiều cơ hội tiếp xúc với mầm bệnh từ môi trường xung quanh. Mặt khác, việc phòng trị ký sinh trùng cho chó vẫn chưa được người dân quan tâm đúng mức nên tỷ lệ chó nhiễm giun cao.
Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi phù hợp với một số nghiên cứu khác đã từng được công bố. Ở nước ta có khoảng 40 triệu người nhiễm giun móc, tỷ lệ nhiễm ở miền Bắc chiếm 30 - 60% (Trương Văn Hội và cs., 2017); tại Hà Nội tỷ lệ nhiễm giun móc chó là 41,67% (Dương Đức Hiếu và cs., 2016). Theo nghiên cứu của Võ Thị Hải Lê tại Nghệ An (2009), sau khi kiểm tra 128 mẫu phân chó, tỷ lệ nhiễm chung của giun tròn đường tiêu hóa là 71,9% và A. caninum là loài có tỷ lệ nhiễm cao nhất tiếp đến là A. braziliense và chó nhiễm Trichuris vulpis với tỉ lệ thấp nhất 5,77%. Quá trình kiểm tra 455 mẫu phân chó của Dagmawi P vào năm 2012 tại khu vực Ethiopia cho thấy tỷ lệ nhiễm của Ancylostoma caninum lên tới 49,9%. Kết quả nghiên cứu tại Campuchia của Inpankaew T et al.(2012) đã cho thấy hơn 57% dân số bị nhiễm giun móc trong số đó, 52% người nhiễm giun móc A. ceylanicum và 90% chó cũng nhiễm A. ceylanicum.
Giun móc có vòng đời trực tiếp, khả năng gây nhiễm vào cơ thể theo nhiều con đường khác nhau (ấu trùng gây nhiễm có thể xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua đường tiêu hóa và qua da). Trong đó, ấu trùng L3 của loài giun móc A. ceylanicum có khả năng phát triển thành dạng trưởng thành trong cơ thể người còn ấu trùng L3 của A. caninum khi xâm nhiễm vào cơ thể người thì chỉ ở dạng ấu trùng di hành dưới da mà không có khả năng phát triển thành dạng trưởng thành. Các ấu trùng L3 này khi xâm nhập vào cơ thể người sẽ di hành đến các cơ
quan trong cơ thể, gây bệnh tích tại đó vậy nên các phương pháp xét nghiệm phân thông thường sẽ không thể đưa ra kết quả chẩn đoán chính xác trong trường hợp này. Không chỉ vậy, trong trường hợp phát triển thành dạng trưởng thành trong đường tiêu hóa, cần phải mất một khoảng thời gian nhất định mới có thể quan sát thấy trứng trong phân thông qua phương pháp phù nổi. Theo O. R. McCoy (1930), cần phải chờ ít nhất 12 ngày từ khi vật chủ bị nhiễm giun móc để có thể bắt đầu sử dụng phương pháp phù nổi trong việc chẩn đoán. Richard D. Bungiro Jr et al.(2005) đã tìm ra rằng, phương pháp phù nổi không cho ra kết quả dương tính với vật chủ bị nhiễm giun móc cho tới ngày thứ 17 kể từ khi nhiễm. Chính vì thế, các phương pháp xét nghiệm phân cơ bản không thể xác định sớm căn bệnh ở những giai đoạn đầu của quá trình phơi nhiễm khi mà giun trưởng thành chưa thải trứng ra ngoài theo phân.
Với mục tiêu thiết lập phản ứng Elisa nhằm chẩn đoán sớm bênh giun móc chó tại phòng khám thú y Gaia, chúng tôi tiến hành phân tích các thành phần protein có trong kháng nguyên thân và kháng nguyên chất tiết của giun móc trưởng thành
4.1.2. Phân tích các thành phần protein kháng nguyên của giun móc.
Sau khi tiến hành phân tích các thành phần protein kháng nguyên của giun móc chó bằng phương pháp điện di SDS-PAGE. Kết quả được trình bày ở Hình 4.1.
Sau khi phân tích thành phần protein kháng nguyên giun móc, chúng tôi xác định được 16 dải protein kháng nguyên thân của giun móc chó có khối lượng dao dộng từ 12 kDa đến 180 kDa và 4 dải kháng nguyên chất tiết của giun móc chó có khối lượng phân tử từ 11 kDa đến 63 kDa.
Đối với dải protein kháng nguyên thân của giun móc có 9 vạch protein có nồng độ cao với khối lượng lần lượt là: 12, 15, 17, 42, 53, 55, 63, 71 và 87 kDa. Và dải kháng nguyên chất tiết xuất hiện 2 vạch protein có nồng độ cao với khối lượng 48 và 63 kDa. Trong đó, những protein có khối lượng 48 và 63 kDa thấy xuất hiện cả bên kháng nguyên thân và kháng nguyên chất tiết.
Còn một số protein chỉ xuất hiện ở kháng nguyên thân mà không xuất hiện ở kháng nguyên chất tiết.
Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Jason et al.(2008), sau khi điện di SDS- PAGE các sản phẩm kháng nguyên chất tiết của giun móc cho thấy khối lượng protein từ 5 kDa đến dưới 250 kDa, các dải protein có mật độ tập trung ở giữa 25-37 kDa và 75-100 kDa. Điều này có thể do trong các nghiên cứu tác giả sử
dụng kháng nguyên chất tiết của loài giun móc A. Caninum. Trong khi đó chúng tôi sử dụng kháng nguyên chất tiết chung của các loài giun móc. Mặt khác, có thể là do sự khác biệt về nồng độ protein hoặc các điều kện biến tính khác nhau nên kết quả có sự khác biệt.
Hình 4.1: Kết quả xác định thành phần kháng nguyên thân và chất tiết giun móc chó trưởng thành bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
Ghi chú: M: Thang khối lượng protein (11-245kDa); SA: Kháng nguyên thân; ES: Kháng nguyên chất tiết; NC: Đối chứng âm
Stefan Michael Geiger et al., 2011 thì protein chất tiết, protein ấu trùng L3 và protein thân có thể làm giảm đáng kể các phản ứng tăng sinh tế bào của các tế bào lympho kích thích đa bào từ các vật chủ nhiễm bệnh. Điều quan trọng, Loukas et al.,1994 cho rằng ấu trùng L3 và A. caninum trưởng thành có chung kháng nguyên ES và kháng nguyên thân, các cơ chế phổ biến của ấu trùng L3 và giun trưởng thành về sự điều hoà phản ứng miễn dịch có thể tạo điều kiện cho ký sinh trùng sống sót.
Kháng nguyên chất tiết giun móc chó (ES) là hỗn hợp các protein và các hợp chất khác, được tiết ra từ miệng hoặc bề mặt ngoài của giun trong quá trình trao đổi chất ( Jason Mulvena, 2008). Trong giun sán, ES cần thiết cho một loạt các hoạt động quan trọng như sự xâm nhập vào vật chủ và mô ( Williamson, 2006), sinh sản (Haffner, 1998) và chống lại đáp ứng miễn dịch của ký chủ (Elliott, 2007). Kháng nguyên chất tiết của giun sản sinh ra có đáp ứng miễn dịch mạnh. Chính vì tầm quan trọng đó, sự hiểu biết về các thành phần protein có trong kháng nguyên chất tiết là cần thiết để định hướng cho những nghiên cứu miễn dịch về bệnh của giun móc trong tương lai.
4.1.3. Kết quả thẩm tách miễn dịch Western Blot trên màng lai PVDF
Sau khi thẩm tách miễn dịch Western Blot sử dụng màng Polyvinylidene Fluoride đối với kháng nguyên chất tiết và kháng nguyên thân giun móc chó chúng tôi có kết quả được trình bày ở hình 4.2
Qua kết quả, chúng tôi đã xác định được các thành phần protein có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng thể của chó nhiễm giun móc. Cụ thể, kháng nguyên thân có 10 vạch protein có khối lượng phân tử lần lượt là 12, 15, 28, 32, 40, 43, 50, 70, 95, 250 kDa. Đặc biệt hơn tại các vạch protein 28, 32, 50, 70, 95 kDa hiện rõ nét trên màng lai. Kháng nguyên chất tiết có 3 vạch protein là 95, 70, 50 kDa. Trong khi đó không thấy xuất hiện vạch protein trên đối chứng âm do kháng nguyên chất tiết không có đáp ứng miễn dịch với kháng thể âm lên không xuất hiện. Những protein có kích thước 95 và 250 kDa có nồng độ protein cao khi chạy SDS-PAGE không thấy xuất hiện khi làm Western Blot, cũng như các band hiện rõ nét trên màng lai không xuất hiện trên bản gel SDS-PAGE. Đó có thể là do phương pháp Western Blot có độ nhạy cao, dùng để phát hiện các thành phần protein có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng thể chó nhiễm bệnh giun móc.
Hình 4.2: Kết quả thẩm tách miễn dịch Western Blot trên màng lai PVDF
Ghi chú: M: Thang khối lượng protein (10-250kDa); ES: Kháng nguyên chất tiết; SA: kháng nguyên thân; PC: Đối chứng dương; NC: Đối chứng âm.
Các thành phần protein có trong kháng nguyên thân và kháng nguyên chất tiết của giun móc được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu về miễn dịch của căn bệnh này. Ngày nay, nhiễm giun móc vẫn là một vấn đề sức khoẻ lớn mà các phương pháp chẩn đoán mới sẽ giúp cải thiện các nghiên cứu dịch tễ học và các nỗ lực trong kiểm soát căn bệnh này. Theo nghiên cứu của Bungiro RD Jr et al.,
2002 thì khi nuôi cấy in vivo, giun trưởng thành A. ceylanicum tạo ra nhiều kháng nguyên chất tiết (protein ES) và 18 thành phần protein trong đó có khả năng miễn dịch cao.
Bin et al.(2005) sau khi thẩm tách miễn dịch trên màng lai PVDF với kháng nguyên chất tiết giun móc A. Caninum thấy protein hiện rõ nét ở khối lượng khoảng 30 kDa. Với mẫu huyết thanh chó đã nhiễm bệnh phát hiện các protein chất tiết loài Unicaria stenocephala có khối lượng phân tử dao động 43- 67 kDa. (Postigo et al., 2003). Andew et al.(1986) cũng xác định được phân tử kháng nguyên thân và chất tiết có khối lượng phân tử là 33 kDa có đáp ứng đặc hiệu với huyết thanh của người nhiễm giun móc N. americanus. So với kết quả của chúng tôi có sự khác nhau, có thể là do các loài giun móc nghiên cứu của các tác giả nêu trên khác với nghiên cứu của chúng tôi. Nhưng có thể nhận ra rằng các protein có khối lượng phân tử dao động 30 kDa đã được tìm thấy trên nhiều loài. Nên có thể protein có khối lượng phân tử 28 kDa và 32 kDa là kháng nguyên chính và có ý nghĩa trong chẩn đoán.