3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Ngan Pháp, vịt Super Meat nghi mắc bệnh nấm phổi (Aspergillosis). Ngan, vịt nuôi tại các hộ gia đình và trang trại chăn nuôi của 6 xã: Nam Phong, Nam Triều, Hồng Thái, Chuyên Mỹ, Đại Thắng, Đại Xuyên từ 5 – 15 ngày tuổi.
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm, bộ môn Bệnh lý, khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Địa điểm theo dõi và lấy mẫu: Tại 6 xã: Nam Phong, Nam Triều, Hồng Thái, Chuyên Mỹ,Đại Thắng, Đại Xuyên.
3.1.3. Nguyên liệu nghiên cứu
- Mẫu bệnh phẩm: Gồm các loại mẫu lấy từ cơ thể ngan, vịt nhiễm hoặc nghi nhiễm Aspergillosis bao gồm: phổi, túi khí, tim, gan, não, ruột, dạ dày… Hóa chất sử dụng làm tiêu bản vi thể: Formol 10%, cồn, xylen, paraffin, thuốc nhuộm heamatoxylin, thuốc nhuộm eosin...
- Dụng cụ
Máy đúc tự động, máy cắt Microtom, máy li tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh gel, tủ ấm 370C, tủ lạnh.
Các dụng cụ khác gồm: lam kính, kính hiển vi, ống eppendoft, pipet, găng tay….
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xác định tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết của đàn ngan, vịt bị bệnh nấm phổi tại Phú Xuyên – Hà Nội.
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của ngan, vịt mắc bệnh nấm phổi. - Xác định sự biến đổi bệnh tích đại thể của ngan, vịt mắc bệnh nấm phổi ở Phú Xuyên – Hà Nội.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp xác định triệu chứng lâm sàng và bệnh tích
Để xác định triệu chứng lâm sàng của ngan, vịt mắc bệnh nấm phổi được xác định bằng phương pháp khám thường quy, theo dõi các chỉ tiêu về trạng thái bên ngoài: ăn uống, hô hấp và trạng thái cơ thể
Mổ khám ngan, vịt bị bệnh để kiểm tra bệnh tích: Quan sát sự biến đổi của niêm mạc phổi, túi khí, yết hầu, màng ngực, bao tim, gan, màng treo ruột và não của con vật mắc bệnh.
3.3.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu theo dõi
Căn cứ vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích. Xác định tỷ lệ mắc bệnh , tỷ lệ chết, tỷ lệ tử vong theo công thức:
Số con ngan, vịt mắc nấm phổi
Tỷ lệ mắc = x 100 Số con theo dõi
Số ngan, vịt chết
Tỷ lệ chết = x 100 Số con theo dõi
Số con chết
Tỷ lệ tử vong = x 100 Số con mắc nấm phổi
3.3.3. Phương pháp điều tra lấy mẫu 3.3.4. Phương pháp làm tiêu bản vi thể 3.3.4. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
* Lấy mẫu bệnh phẩm để kiểm tra bệnh tích vi thể
Khi tiến hành mổ khám quan sát hạt nấm ở các cơ quan phủ tạng và lấy mẫu bệnh phẩm để kiểm tra những biến đổi bệnh tích mà mắt thường không nhìn thấy trên kính hiển vi cần phải chọn lọc, bảo quản và cố định mẫu bệnh phẩm đúng phương pháp:
+ Bệnh phẩm lấy không dày quá 0,5 cm, đủ rộng để định được tổ chức gốc, hai mặt cắt phải song song.
+ Bệnh phẩm được lấy phải gồm cả phần lành lẫn phần bệnh, miếng tổ chức phải tươi, tốt nhất là lấy sau khi giết, mổ khám phải lấy ngay. Nếu ở ngan, vịt chết phải lấy trước 6h sau khi chết (vì thời gian muộn hơn xác sẽ có hiện tượng hoại tử).
+ Động tác lấy mẫu phải nhẹ nhàng, chính xác tránh đụng chạm mạnh vì dễ gây dập nát do tác nhân cơ học.
+ Không dùng kẹp, panh kẹp vào những vùng tổ chức sẽ lấy mẫu. Không bóp mạnh, rửa mẫu.
+ Khi cắt phải dùng dao sắc và cắt theo một hướng.
+ Lấy mẫu xong phải cố định ngay, tránh hiện tượng tự hoại tử sau khi chết của tế bào.
* Cố định mẫu
- Tất cả các tổ chức cơ thể lấy bệnh phẩm đều được ngâm trong dung dịch cố định, đặc biệt đối với phổi thường hay nổi nên bọc trong một lớp bông rồi ngâm vào thuốc cố định.
- Chiều dày mẫu vật có ảnh hưởng đến kết quả cố định, do vậy chiều dày bệnh phẩm không được quá 0,5cm.
- Khối lượng thuốc cố định tối thiểu là một phần mẫu vật, chín phần thuốc cố định.
- Thời gian cố định phụ thuộc vào từng loại thuốc cố định. Thông thường cố định mẫu vật từ 24-48 giờ, nếu quá thời gian cố định đó phải đổ hoá chất cũ đi, thay bằng chất cố định mới.
- Nhiệt độ cố định cao thì khả năng ngấm của chất cố định tăng, nhiệt độ thông thường là 30-37OC.
- Rửa mô sau khi cố định để làm mất các chất cố định, thời gian rửa ngang với thời gian cố định là tốt nhất.
Thuốc cố định chất khoáng: axit khoáng và muối khoáng Thuốc cố định axit khoáng: acid chromic, acid osmic.
Thuốc cố định muối khoáng: bichromat kiềm, bichromat acid…
Thuốc cố định hữu cơ:
Các chất khử oxy hữu cơ: methylic, ethylic, folmandehyd.
Thuốc cố định hỗn hợp
Dung dịch Bouin (acid acetic, acid picric, focmol)
Dung dịch Duboscq – Brasin (cồn, focmol, acid acetic, acod picric) Dung dịch Carnoy (cồn, chloroform, acid acetic)
Những thuốc cố định thường dùng là: Formalin salin: Formandehyd 40% 10ml NaCl 0,9g Nước cất vừa đủ 10ml Bouin:
Dung dịch acid picric bão hoà 75ml Formaldehyd 40% 25ml
Acid acetic 5ml
* Phương pháp tạo khuôn mẫu vật:
- Mục đích tạo khuôn mẫu vật là gắn mẫu vật vào một khối nến khi nến đã thấm vào những chi tiết nhỏ nhất của tổ chức, tế bào. Khi nến đông lại tạo thành một khối duy nhất. Nhờ có khối này mà việc cắt mô thành những lát mỏng trở nên dễ dàng cần thiết cho việc chẩn đoán vi thể trên kính hiển vi quang học.
* Phương pháp tẩm nến:
Nến là chất lấy từ dầu mỏ có nhiều điểm nóng chảy khác nhau từ 35-65oC. Nến không hoà tan trong nước, rất ít tan trong cồn, rất dễ hoà tan trong chloroform, toluene, xylen.
Để tẩm nến tạo khuôn phải trải qua các giai đoạn sau:
+ Khử nước: Bệnh phẩm sau khi được cố định, được rửa qua nước chuyển ngâm vào các nồng độ cồn khác nhau (cồn 70o, 90o, 100o) để khử nước. Mỗi cốc cồn không cần khối lượng quá lớn mà chỉ cần ngâm ngập trên bề mặt miếng bệnh phẩm khoảng 1cm. Thời gian khử nước tuỳ theo độ dày của miếng bệnh phẩm. Mục đích khử nước là để rút hết nước trong bệnh phẩm mà không làm bệnh phẩm thay đổi cấu trúc bên trong. Muốn biết miếng bệnh phẩm đã khử nước hết chưa chỉ cần cho miếng bệnh phẩm vào cốc xylol. Nếu bệnh phẩm đã hết nước
thì cốc xylol vẫn trong, cốc xylol vẩn đục màu trắng sữa thì chứng tỏ nước vẫn còn và phải mang khử lại trong cồn 100o.
Dung dịch để khử nước là loại cồn etylic, methylic, butylic.
+ Làm trong bệnh phẩm: Mục đích dùng dung dịch của nến để tẩy cồn ngấm trong bệnh phẩm sau khi rút nước. Dung dịch sử dụng phải vừa hoà tan cồn, vừa hoà tan nến. Chất thường dùng là xylol. Thời gian ngâm tuỳ theo dung dịch (thường chuyển qua 2 cốc) đến khi miếng bệnh phẩm trong như miếng thạch là được.
+ Làm ngấm nến: Miếng bệnh phẩm đã được làm trong chuyển qua 3 bát nến nóng chảy với nhiệt dộ phù hợp.
+ Tạo khuôn bệnh phẩm: Miếng bệnh phẩm ngấm nến được tạo khuôn để cắt. Lấy miếng bệnh phẩm từ bát nến, đặt vào đáy khuôn đã có nến nóng chảy, định hướng miếng bệnh phẩm cho đúng (mặt cắt phải đặt xuống dưới). Sau đó làm lạnh trong nước hoặc trong tủ lạnh. Đánh dấu bệnh phẩm bằng cách dùng que nhọn viết vào cạnh khối nến.
* Phương pháp cắt: Mục đích cắt bệnh phẩm thành những lát mỏng, ánh
sáng có thể đi qua khi nghiên cứu bằng kính hiển vi quang học. Bệnh phẩm được cắt trên máy gồm 4 giai đoạn:
- Chuẩn bị khuôn nến: gọt khối nến thành hình chóp cụt, gọt mặt cắt khối nến cho phẳng sát tới miếng bệnh phẩm sau đó gắn vào bộ phận mang trên máy.
- Đặt dao vào máy: độ lệch của lưỡi dao khoảng từ 15 – 30o so với mặt của khối nến
- Cắt bệnh phẩm: Trước khi cắt phải điều chỉnh độ dày, có thể bắt đầu bằng độ dày từ 10 – 16µ, sau khi đã cắt bằng khối nến thì điều chỉnh độ dày từ 3-5µ.
+ Dán lát cắt vào phiến kính: Lát cắt đã cắt thành băng lấy ra khỏi lưỡi dao nhẹ nhàng, cẩn thận. Đặt cả băng trên phiến giấy đen, tách một lát cắt ra khỏi băng. Đặt lên phiến kính để dán vào đó, trước khi dán phải làm cho lát cắt giãn phẳng: đặt lát cắt vào nồi nước nóng 40oC để giãn phẳng, luồn phiến kính xuống dưới, vớt lát cắt, dán lên phiến kính bằng dung dịch lòng trắng trứng.
* Nhuộm lát cắt: Nhuộm màu là một khâu quan trọng trong chẩn đoán bệnh. Khi nhuộm màu, do mô và tế bào có cấu tạo khác nhau nên tính chất bắt màu của nó cũng khác nhau, tạo ra các độ tương phản giữa các thành phần nên dễ nhận biết. Mỗi thành phần tế bào và mô có ái lực đối với một loại thuốc nhuộm,
nên khi được nhuộm màu mỗi thành phần có màu đặc biệt, căn cứ vào đó người chẩn đoán có thể phân biệt được những thay đổi của tổ chức.
Thuốc nhuộm có nhiều loại: Người ta chia thành 2 nhóm: thuốc thiên nhiên và thuốc nhân tạo
Thuốc nhuộm thiên nhiên: Haematoxylin…
Thuốc nhuộm nhân tạo: Xanh methylen, tím methyl… Các phương pháp nhuộm màu:
+ Nhuộm tăng dần: nhuộm lát cắt tăng dần cho đến khi bắt màu vừa đủ, trong thời gian nhuộm, thỉnh thoảng kiểm tra độ nhuộm màu dưới kính hiển vi.
+ Nhuộm màu giảm dần: nhuộm lát cắt thật đậm, sau đó tẩy dần cho đến khi lát cắt có màu vừa ý.
* Quy trình làm và nhuộm tiêu bản vi thể:
Làm tiêu bản
Lấy bệnh phẩm độ dày không quá 0,5cm
Ngâm trong formalin 10% 24h Cắt lại mẫu dày 0,2mm, rửa vòi nước chảy 2h Ngâm trong cồn 70o 3h Ngâm trong cồn 90o 2h Ngâm trong cồn 100o 3 lần thay đổi 2h/lần Ngâm trong xylol 3 lần thay đổi 1h/lần Tẩm trong nến nóng chảy 3 lần thay đổi 2h/lần Tạo khuôn trong nến
Gọt khuôn đưa vào máy cắt Cắt lát dày 4µ
Làm phẳng trên nước ấm
Dán vào lam kính bằng lòng trắng trứng
Hong khô tiêu bản trong tủ ấm 37oC 3h
Nhuộm tiêu bản theo phương pháp paraffin
Loại xylol bằng cồn 100o 2 lần thay đổi 5 phút Lấy nước vào lát cắt bằng cồn 90o 5 phút Lấy nước vào lát cắt bằng cồn 70o 5 phút
Ngâm nước chảy 5 phút
Ngâm nước cất 5 phút
Nhuộm Haematoxylin 10 phút Rửa nước chảy để tiêu bản chuyển màu xanh 5 phút
Ngâm nước cất 5 phút
Nhuộm bằng Eosin 90 giây
Rửa nước chảy 10 phút
Rút nước với cồn 96o 5 phút Ngâm cồn 100o 3 lần thay đổi 2 phút/lần Ngâm xylol 3 lần thay đổi 2 phút/lần Gắn lam kính bằng baume Canada
Đánh dấu lát cắt bệnh phẩm trên phiến kính theo quy định. * Đọc tiêu bản vi thể
Quá trình đọc tỉêu bản cần qua một số bước: - Xác định nguồn gốc tổ chức:
+ Đưa tiêu bản quan sát dưới ánh sáng tự nhiên. + Đưa tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi. + Đọc lướt tiêu bản dưới độ bội giác thấp.
- Quan sát toàn bộ những phần vi thể bình thường khác nhau (ở bội giác thấp) để tìm vùng biến đổi bệnh lý vi thể.
- Quan sát những vùng biến đổi vi thể ở bội giác cao hơn để xác định loại biến đổi, do viêm mãn tính hay cấp tính, do khối u hay vi khuẩn…
3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Excell.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH BỆNH NẤM PHỔI TRÊN ĐÀN NGAN, VỊT NUÔI TẠI PHÚ XUYÊN - HÀ NỘI NUÔI TẠI PHÚ XUYÊN - HÀ NỘI
Tiến hành điều tra các đàn ngan, vịt tại 6 xã thuộc huyện Phú Xuyên: Nam Phong, Nam Triều, Hồng Thái, Chuyên Mỹ, Đại Thắng, Đại Xuyên. Trong quá trình điều tra nhận thấy đàn thủy cầm hay mắc các bệnh: Bệnh viêm gan vịt, dịch tả vịt, tụ huyết trùng, phó thương hàn, tụ cầu trùng, nhiễm khuẩn do Ecoli, nấm phổi…
Những đàn thủy cầm mắc bệnh và chết do bệnh nấm phổi được thống kê ghi lại, kết quả được trình bày ở bảng 4.1.
Qua bảng 4.1 ta thấy tại xã Nam Triều và Đại Thắng có tỷ lệ ngan, vịt mắc bệnh và chết chiếm tỷ lệ cao nhất. Xã Nam Triều tôi theo dõi đàn ngan, vịt 7 ngày tuổi thì tỷ lệ mắc bệnh là 56,20%; tỷ lệ chết 48%. Tại xã Đại Thắng được theo dõi ở lứa tuổi 5 ngày tuổi có tỷ lệ mắc bệnh là 68,4%; tỷ lệ chết 65%. Các xã khác theo dõi ở các lứa tuổi lớn hơn thì tỷ lệ mắc và chết ít hơn.
Bảng 4.1. Tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết của ngan, vịt mắc bệnh nấm phổi tại 1 số xã thuộc huyện Phú Xuyên – Hà Nội. STT Tên xã Tổng đàn
ngan, vịt
Lứa tuối Số con theo dõi Số con mắc bệnh Số con chết Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) 1 Nam Phong 300 13 326 81 24,85 70 21,50 2 Nam Triều 367 7 411 231 56,20 197 48,00 3 Hồng Thái 429 10 204 84 41,18 76 37,30 4 Chuyên Mỹ 200 15 522 113 21,65 95 18,20 5 Đại Thắng 250 5 288 197 68,40 187 65,00 6 Đại Xuyên 258 11 174 75 43,10 62 35,70
Từ đó ta có thể thấy bệnh nấm phổi gặp ở ngan, vịt ở các lứa tuổi, cao nhất là thời điểm 5 – 7 ngày tuổi.
Tỷ lệ chết dao động từ 18,20 đến 65,00%. Ngan, vịt càng nhỏ tuổi thì tỷ lệ chết càng cao; đàn thủy cầm bị bệnh lúc 5 ngày tuổi, tỷ lệ chết là 65,00%; đàn thủy cầm bị bệnh lúc 7 ngày tuổi, tỷ lệ chết là 48,00%; đàn thủy cầm mắc bệnh lúc 15 ngày tuổi, tỷ lệ chết thấp: 18,20%.
Theo nghiên cứu của nhều tác giả, bệnh nấm phổi gia cầm chủ yếu do Aspergillus fumigatus gây ra, bệnh thường gây chết nhiều ở gia cầm non, tỷ lệ chết rất cao, đến 50,00% và đôi khi đến 100,00% (Nguyễn Thát, 1997).
Tỷ lệ chết của bệnh cao có thể được giải thích bởi cấu tạo của cơ quan hô hấp, do các túi khí nên khả năng thông khí mạnh, kết hợp với thân nhiệt cao tạo điều kiện tốt cho sự phát triển của nấm. Ở thủy cầm non sức đề kháng yếu nên tỷ lệ chết rất cao; còn ở thủy cầm lớn, thường mắc thể mạn tính nên tỷ lệ chết không cao. Theo nghiên cứu của Phạm Minh Đạo (1999), tỷ lệ ngan chết do nấm phổi trong ổ dịch tại Nam Định là 81% (KHKT Thú y số 4 - 1999) (Phạm Minh Đạo, 1999).
Bệnh xảy ra với tỷ lệ cao như vậy cũng có thể là do ngan đã bị nhiễm bệnh từ trứng hoặc từ trong máy ấp, kết hợp với điều kiện nền chuồng ẩm ướt, chất độn chuồng kém chất lượng, không được thay thường xuyên cho nên bệnh phát ra rất sớm và trầm trọng gây thiệt hại nhiều về kinh tế.
Một số tác giả khác nghiên cứu về bệnh nấm phổi trên gà cũng thấy tỷ lệ chét cao, theo tác giả Phạm Sỹ Lăng và cộng sự thì tỷ lệ chết là 50,00 – 70,00% (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2005) ;theo tác giả Lê Hồng Mận và Xuân Giao thì tỷ lệ chết là 5,00 – 50,00% (Lê Hồng Mận và Xuân Giao, 2002).
Nhiều nghiên cứu trước đây cũng đều khẳng định bào tử nấm phân bố rất rộng trong tự nhiên. Chúng có sức đề kháng rất cao với môi trường và có nhiều đường lây nhiễm như qua trứng, qua đường hô hấp. Chính vì vậy mà nếu trứng hay máy ấp có nhiễm bào tử nấm thì gia cầm non sẽ bị bệnh vè bệnh diễn ra rất sớm và trầm trọng. Điều đó càng khẳng định công tác vệ sinh thú y là rất quan trọng.
Chúng tôi đã khuyến cao với các hộ chăn nuôi nên mua ngan, vịt từ những nơi an toàn về dịch bệnh, từ những trung tâm giống đảm bảo chất lượng và phải nuôi Ngan trong điều kiện vệ sinh thú y tốt.
Trong quá trình thực tập chúng tôi có tiến hành điều tra những ngan, vịt lớn hơn 15 ngày tổi thì thấy tỷ lệ chết do nấm phổi thường ít hơn và bệnh thường