Phần 3 Đối tượng nội dung phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp điều tra
Tiến hành điều tra hiện trạng phân phối thịt lợn trên địa bàn quận Long Biên bằng hình thức phỏng vấn trực tiếp người bán thịt lợn theo bảng câu hỏi.
3.4.2. Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại các quầy bán thịt tại một số chợ thuộc quận Long Biên, Hà Nội. Lấy mẫu theo TCVN: Thịt và sản phẩm của thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử: TCVN 4833 – 1:2002, TCVN 4833 – 2:2002. Mẫu sau khi lấy phải đựng trong các hộp vô trùng, bảo quản lạnh và được vận chuyển về phòng thí nghiệm.
3.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli và Salmonella
3.4.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli
Qui trình định lượng E. coli (cfu/g) bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch Macconkey. Theo TCVN 4833 – 2:2002
1/ Cân 10 g thịt mẫu, cắt nhỏ mẫu chứa trong túi dập mẫu. Bổ sung 90ml dung dịch Pepton và nghiền nhỏ bằng máy nghiền mẫu
1ml dung dịch từ túi mẫu nghiền sang ống thủy tinh chứa 9ml dung dịch Peptop. 3/ Cấy láng 100µl dung dich pha loãng trên đĩa thạch Mac (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa), Nuôi tủ ấm 37 ºC/ 24h
4/ Đếm các khuẩn lạc có màu hồng cánh sen trên đĩa thạch. Chọn 2 nồng độ pha loãng liền nhau có số khuẩn lạc đếm được trên mỗi đĩa ≤ 250 để đếm số lượng khuẩn lạc trên mỗi đĩa và tính toán kết quả theo công thức sau:
N= ∑
,
Trong đó:
N: là số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu.
∑ :là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn.
1 : là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 1
1 : là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 2
d : là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất
3.4.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp phát hiện
Salmonella trên đĩa thạch TCVN 4829 : 2005 (ISO 6579 : 2002).
Bước 1: Tăng sinh
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW và đồng nhất bằng Stomacher trong 2 phút. Ủ ở 37 ºC trong 18-24 giờ.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh và chuyển 0,1 ml sang ống chứa 10 ml môi trường tăng sinh Rappaport-Vassliadis Soya Pepton (RV) đã được ủ ấm đến 42ºC. Sau đó ủ ở 42ºC trong 18-24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ. Chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh thu được vào ống chứa 1ml Muller Kauffmann tetrathionat ủ ở 37ºC trong 24 giờ.
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Từ môi trường Rappaport–Vassliadis Soya Pepton cấy chuyển sang môi trường BGA, ủ 37ºC/24 giờ. Đọc kết quả: khuẩn lạc có màu đỏ hồng, tròn bóng,
lồi trên mặt thạch. Từ môi trường Muller Kauffmann ria cấy sang môi trường XLT4, ủ 37ºC/24 giờ. Đọc kết quả: khuẩn lạc có màu đen, tròn bóng, lồi trên mặt thạch.
Bước 4: Khẳng định
Thử nghiệm H2S: Cấy khuẩn lạc trên môi trường TSI. Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong các môi trường trên vì thế phần thạch nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella
đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Vi khuẩn sinh hơi làm rạn nứt thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên tạo một khoảng không dưới đáy ống nghiệm.
Thử nghiệm urea: Salmonella không phân giải ure nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường canh thang ure vẫn giữ nguyên màu vàng cam.
Thử nghiệm Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường Tryptophan. Ủ ở 37ºC trong 24 giờ. Sau khi ủ nhỏ 1 giọt thuốc thử Kovac’s. Nếu xuất hiện vòng màu đỏ - phản ứng dương tính. Nếu xuất hiện vòng màu nâu vàng - phản ứng âm tính.
3.4.3.3. Phương pháp kháng sinh đồ
Phương pháp Bauer - Kirby dùng để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn mô tả bởi Carter và Cole năm 1990 được sử dụng trong thí nghiệm này. Đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh dựa vào bảng đánh giá kết quả của M100-S24 theo Wayne (2014). Vi khuẩn phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm cấy sang môi trường thạch ống nghiêng NA (Nutrient agar), để 37ºC/24 giờ. Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào 9 ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, lắc đều và điều chỉnh để có độ đục Mc Farland 0,5. Sau đó lấy tăm bông vô trùng thấm huyễn dịch vi khuẩn trải đều trên bề mặt đĩa thạch Muller – Hinton (MH). Đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt đĩa thạch đã được trải trùng, mỗi đĩa thạch đặt 5-6 khoanh giấy tẩm kháng sinh. Để 37ºC /18-24 giờ.
Các bước tiến hành như sau:
-Bước 1: chuẩn bị môi trường thạch Muller – Hinton.
-Bước 2: các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp được dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muller – Hinton.
-Bước 4: nuôi dư để đánh giá mức độ nhảy Hình 3.1 Vòng vô Kết quả được đọc mẫn cảm hay đề kháng c Bảng 3.1. Bảng đánh giá TT Loại kháng 1 Amoxicillin 2 Ampicillin 3 Kanamycin 4 Streptomycin 5 Gentamicin 6 Neomycin 7 Doxycycline 8 Tetracycline 9 Colistin 10 Sulfamethoxazole/ Ghi chú: S (Suscep I (Interme R ( Resist (M100-S2
ưỡng ở 37ºC trong 18-24 giờ, đo đường kính ộ nhảy cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn
òng vô khuẩn của vi khuẩn trên thạch Muelle
ợc đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn háng của vi khuẩn với kháng sinh tương ứng tại
nh giá mức độ mẫn cảm với một sốloại kháng si
kháng sinh Ký hiệu Lượng ks (µg) Đườn vô k R (≤) AMC 10 13 AMP 10 13 KAN 30 13 STH 10 11 GEN 10 12 NEO 30 12 DOX 30 10 TCY 30 11 COL 10 14 azole/trimethoprim STX 25 10 usceptible): mẫn cảm cao ntermediate): mẫn cảm trung bình Resistant): Kháng
S24: Tiêu chuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh t
ng kính vòng vô khuẩn khuẩn
Mueller-Hinton
ẩn để xác định tính ng tại bảng 3.1.
áng sinh của vi khuẩn
ờng kính vòng vô khuẩn (mm) I S (≥) 14 – 16 17 14 – 16 17 14 – 17 18 12 – 14 15 13 – 14 15 13 – 16 17 11 – 13 14 12 – 14 15 15 – 17 18 11 – 15 16
Các loại kháng sinh được chọn để kiểm tra khả năng mẫn cảm của vi khuẩn E. coli và Salmonella trong nghiên cứu này dựa theo tiêu chuẩn của Quốc tế về danh mục kháng sinh cần kiểm soát đối với vi khuẩn kháng thuốc.
3.4.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2010.
Số trung bình: = ∑
Trong đó: : Số trung bình
xi: Số hạng thứ i
n: Dung lượng mẫu
Độ lệch chuẩn: Sx = ∑
Sai số trung bình: m = ± #$
√ (Với n≥ 30)
' = ± #$