3.1.1. Đối tượng nghiên cứu.
- Các mẫu thịt lợn thu thập được tại một số chợ thuộc quận Long Biên, Hà Nội.
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Trong điều kiện cho phép, phạm vi đề tài chỉ đề cập đến các chỉ tiêu: Vi khuẩn E. coli, vi khuẩn Salmonella.
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu.
Địa điểm lấy mẫu: mẫu được thu thập tại một số chợ thuộc quận Long Biên, Hà Nội.
Địa điểm phân tích: sau khi được thu thập mẫu sẽ được chuyển về Phòng thí nghiệm Bộ môn Thú y cộng đồng - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam để tiến hành phân tích..
3.1.4. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được nghiên cứu và thực hiện từ tháng 12 năm 2018 đến tháng 07 năm 2019
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Điều tra hiện trang phân phối thịt lợn tại Quận Long Biên
- Ngiên cứu xác dịnh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E . coli và Salmonella trong thịt lợn tại một số chợ nhỏ lẻ trên địa bàn quận Long Biên.
- Xác định tính khánh kháng sinh của vi khuẩn phân lập được.
3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Mẫu xét nghiệm 3.3.1. Mẫu xét nghiệm
Mẫu thịt lợn được lấy vào 7-8 giờ sáng tại một số chợ thuộc quận Long Biên, Hà Nội.
3.3.2. Hóa chất, môi trường
3.3.2.1. Hóa chất, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn E. coli
Môi trường Pepton Buffered Water (PBW), môi trường MacConkey (Mac)
3.3.2.2. Hóa chất, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella
Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RV), môi trường Muller Kauffman Tetrathionate (MKTTn), môi trường Xyloze-Lyzine-Tergitol 4 (XLT4), môi trường Brilliant Green Agar (BGA), môi trường Triple Sugar Iron Agar (TSI), môi trường SS agar, môi trường thạch máu, Thuốc thử Kovac’S.
3.3.2.3. Hóa chất, môi trường dùng làm kháng sinh đồ
Khoanh giấy tẩm kháng sinh: Sulfamethoxazole/ Trimethoprim (STX) 25µg, Ampicillin (AMP) 10µg, Colistin (COL) 10µg, Amoxcillin (AMX) 10µg, Neomycin (NEO) 30µg, Kanamycin (KAN) 30µg, Doxycycline (DOX) 30µg, Streptomycin (SSTH) 10µg, Tetracycline (TCY) 30µg, Gentamycine (GEN) 10µg, môi trường thạch Muller - Hinton agar.
3.3.3. Trang thiết bị và dụng cụ
a. Trang thiết bị
Cân điện tử, máy dập mẫu, buồng cấy, nồi hấp, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, máy Vortex.
b. Dụng cụ
Ttúi PE vô trùng, hộp giữ lạnh, dao, kéo, kẹp, đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc đong, ống đong, pipet, que cấy…
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phương pháp điều tra 3.4.1. Phương pháp điều tra
Tiến hành điều tra hiện trạng phân phối thịt lợn trên địa bàn quận Long Biên bằng hình thức phỏng vấn trực tiếp người bán thịt lợn theo bảng câu hỏi.
3.4.2. Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại các quầy bán thịt tại một số chợ thuộc quận Long Biên, Hà Nội. Lấy mẫu theo TCVN: Thịt và sản phẩm của thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử: TCVN 4833 – 1:2002, TCVN 4833 – 2:2002. Mẫu sau khi lấy phải đựng trong các hộp vô trùng, bảo quản lạnh và được vận chuyển về phòng thí nghiệm.
3.4.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli và Salmonella
3.4.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli
Qui trình định lượng E. coli (cfu/g) bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch Macconkey. Theo TCVN 4833 – 2:2002
1/ Cân 10 g thịt mẫu, cắt nhỏ mẫu chứa trong túi dập mẫu. Bổ sung 90ml dung dịch Pepton và nghiền nhỏ bằng máy nghiền mẫu
1ml dung dịch từ túi mẫu nghiền sang ống thủy tinh chứa 9ml dung dịch Peptop. 3/ Cấy láng 100µl dung dich pha loãng trên đĩa thạch Mac (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa), Nuôi tủ ấm 37 ºC/ 24h
4/ Đếm các khuẩn lạc có màu hồng cánh sen trên đĩa thạch. Chọn 2 nồng độ pha loãng liền nhau có số khuẩn lạc đếm được trên mỗi đĩa ≤ 250 để đếm số lượng khuẩn lạc trên mỗi đĩa và tính toán kết quả theo công thức sau:
N= ∑
,
Trong đó:
N: là số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu.
∑ :là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa đã chọn.
1 : là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 1
1 : là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ 2
d : là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất
3.4.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella
Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phương pháp phát hiện
Salmonella trên đĩa thạch TCVN 4829 : 2005 (ISO 6579 : 2002).
Bước 1: Tăng sinh
Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW và đồng nhất bằng Stomacher trong 2 phút. Ủ ở 37 ºC trong 18-24 giờ.
Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh và chuyển 0,1 ml sang ống chứa 10 ml môi trường tăng sinh Rappaport-Vassliadis Soya Pepton (RV) đã được ủ ấm đến 42ºC. Sau đó ủ ở 42ºC trong 18-24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ. Chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh thu được vào ống chứa 1ml Muller Kauffmann tetrathionat ủ ở 37ºC trong 24 giờ.
Bước 3: Phân lập và nhận diện
Từ môi trường Rappaport–Vassliadis Soya Pepton cấy chuyển sang môi trường BGA, ủ 37ºC/24 giờ. Đọc kết quả: khuẩn lạc có màu đỏ hồng, tròn bóng,
lồi trên mặt thạch. Từ môi trường Muller Kauffmann ria cấy sang môi trường XLT4, ủ 37ºC/24 giờ. Đọc kết quả: khuẩn lạc có màu đen, tròn bóng, lồi trên mặt thạch.
Bước 4: Khẳng định
Thử nghiệm H2S: Cấy khuẩn lạc trên môi trường TSI. Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong các môi trường trên vì thế phần thạch nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Đa số các dòng Salmonella
đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Vi khuẩn sinh hơi làm rạn nứt thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên tạo một khoảng không dưới đáy ống nghiệm.
Thử nghiệm urea: Salmonella không phân giải ure nên không làm thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường canh thang ure vẫn giữ nguyên màu vàng cam.
Thử nghiệm Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường Tryptophan. Ủ ở 37ºC trong 24 giờ. Sau khi ủ nhỏ 1 giọt thuốc thử Kovac’s. Nếu xuất hiện vòng màu đỏ - phản ứng dương tính. Nếu xuất hiện vòng màu nâu vàng - phản ứng âm tính.
3.4.3.3. Phương pháp kháng sinh đồ
Phương pháp Bauer - Kirby dùng để đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn mô tả bởi Carter và Cole năm 1990 được sử dụng trong thí nghiệm này. Đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh dựa vào bảng đánh giá kết quả của M100-S24 theo Wayne (2014). Vi khuẩn phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm cấy sang môi trường thạch ống nghiêng NA (Nutrient agar), để 37ºC/24 giờ. Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào 9 ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, lắc đều và điều chỉnh để có độ đục Mc Farland 0,5. Sau đó lấy tăm bông vô trùng thấm huyễn dịch vi khuẩn trải đều trên bề mặt đĩa thạch Muller – Hinton (MH). Đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt đĩa thạch đã được trải trùng, mỗi đĩa thạch đặt 5-6 khoanh giấy tẩm kháng sinh. Để 37ºC /18-24 giờ.
Các bước tiến hành như sau:
-Bước 1: chuẩn bị môi trường thạch Muller – Hinton.
-Bước 2: các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp được dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muller – Hinton.
-Bước 4: nuôi dư để đánh giá mức độ nhảy Hình 3.1 Vòng vô Kết quả được đọc mẫn cảm hay đề kháng c Bảng 3.1. Bảng đánh giá TT Loại kháng 1 Amoxicillin 2 Ampicillin 3 Kanamycin 4 Streptomycin 5 Gentamicin 6 Neomycin 7 Doxycycline 8 Tetracycline 9 Colistin 10 Sulfamethoxazole/ Ghi chú: S (Suscep I (Interme R ( Resist (M100-S2
ưỡng ở 37ºC trong 18-24 giờ, đo đường kính ộ nhảy cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn
òng vô khuẩn của vi khuẩn trên thạch Muelle
ợc đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn háng của vi khuẩn với kháng sinh tương ứng tại
nh giá mức độ mẫn cảm với một sốloại kháng si
kháng sinh Ký hiệu Lượng ks (µg) Đườn vô k R (≤) AMC 10 13 AMP 10 13 KAN 30 13 STH 10 11 GEN 10 12 NEO 30 12 DOX 30 10 TCY 30 11 COL 10 14 azole/trimethoprim STX 25 10 usceptible): mẫn cảm cao ntermediate): mẫn cảm trung bình Resistant): Kháng
S24: Tiêu chuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh t
ng kính vòng vô khuẩn khuẩn
Mueller-Hinton
ẩn để xác định tính ng tại bảng 3.1.
áng sinh của vi khuẩn
ờng kính vòng vô khuẩn (mm) I S (≥) 14 – 16 17 14 – 16 17 14 – 17 18 12 – 14 15 13 – 14 15 13 – 16 17 11 – 13 14 12 – 14 15 15 – 17 18 11 – 15 16
Các loại kháng sinh được chọn để kiểm tra khả năng mẫn cảm của vi khuẩn E. coli và Salmonella trong nghiên cứu này dựa theo tiêu chuẩn của Quốc tế về danh mục kháng sinh cần kiểm soát đối với vi khuẩn kháng thuốc.
3.4.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2010.
Số trung bình: = ∑
Trong đó: : Số trung bình
xi: Số hạng thứ i
n: Dung lượng mẫu
Độ lệch chuẩn: Sx = ∑
Sai số trung bình: m = ± #$
√ (Với n≥ 30)
' = ± #$
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA HIỆN TRẠNG PHÂN PHỐI THỊT LỢN TẠI QUẬN LONG BIÊN QUẬN LONG BIÊN
Kết quả điều tra về điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm được chúng tôi tổng hợp và trình bày ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả điều tra điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm tại các quầy thịt lợn (n=50)
Điều kiện cơ sở vật chất Tiêu chí
đánh giá
Số quầy (n = 50)
Tỷ lệ (%)
Chiều cao của quầy hàng ≥ 60 cm 46 92 ≤ 60 cm 4 8 Vật liệu làm mặt bàn Kim loại 10 20 Gạch men 30 60 Gỗ 10 20 Tủ bảo quản thực phẩm Có 25 50 Không 25 50 Dụng cụ xua đuổi côn trùng Có 41 82 Không 9 18 Đeo tạp dề khi bán hàng Có 45 90 Không 5 10
Nguồn nước Nước máy 50 100
Nước ngầm 0 0
Tập huấn kiến thức vệ sinh an toàn thực phẩm
Có 33 66
Không 17 34
Kết quả bảng 4.1 cho thấy: 92% quầy bán thịt lợn tại 7 chợ được điều tra đạt tiêu chuẩn về chiều cao theo quy định của Bộ Y Tế (≥ 60 cm). Trong số các quầy thịt điều tra chỉ có 10 (20%) quầy có mặt bàn làm bằng kim loại, 30 (60%) số quầy có mặt bàn làm bằng gạch men, còn lại 10 (20%) số quầy hàng sử dụng vật liệu làm mặt bàn khó vệ sinh là gỗ.
Qua khảo sát trong số 50 quầy diều tra có 25 (50%) quầy có tủ bảo quản thực phẩm. Dụng cụ xua đuổi côn trùng là một công cụ hữu ích giúp hạn chế phát
tán vi khuẩn từ côn trùng vào thịt. Khi thịt bị nhiễm khuẩn, từ bề mặt thịt vi sinh vật sẽ phát triển ngấm sâu vào bên trong làm hư hỏng thịt. Nhưng không phải người bán nào cũng ý thức được vấn đề này, trong số 50 quầy điều tra có 41 quầy (82%) có dụng cụ xua đuổi côn trùng, còn lại không sử dụng.
Qua quan sát trực tiếp của chúng tôi, có 90% người bán thịt lợn đeo tạp dề khi bán hàng. Nguồn nước sử dụng 100% quầy bán thịt đều dùng nước máy và qua phỏng vấn trực tiếp 50 người bán thịt lợn, chỉ có 33/50 người (66%) đã từng tham gia các lớp tập huấn kiến thức về an toàn vệ sinh thực phẩm nhưng không ai trong số này giữ lại giấy chứng nhận đã tham gia tập huấn. Điều này phản ánh thực trạng là vẫn còn rất nhiều người bán hàng không được tập huấn về vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm hoặc nếu được tập huấn thì cũng không thực sự quan tâm đến vấn đề này.
Thịt là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, cung cấp nguồn protein chủ yếu trong các bữa ăn nên lượng tiêu thụ thịt hàng ngày là rất lớn. Các loại thịt được bày bán bao gồm: thịt lợn, thịt gà, thịt bò, thịt vịt... Thói quen của người tiêu dùng Việt Nam nói chung thường là mua thịt tươi sống với số lượng đủ dùng trong ngày và ít khi lưu trữ trong thời gian dài. Qua điều tra 7 chợ trên địa bàn Quận Long Biên có kết quả như:
Bảng 4.2. Thống kê các loại thịt được bày bán tại một số chợ thuộc Quận Long Biên, Hà Nội
STT Tên chợ bày bán Số bàn thịt(n) Thịt lợn (%) Thịt bò (%) Thịt gia cầm (%) Các loại thit khác (%) 1 Chợ Sài Đồng 21 47,62 19,05 33,33 0 2 Chợ Gia Lâm 40 57,5 17,5 25 0 3 Chợ Diêm Gỗ 50 56 10 10 24 4 Chợ Vũ Xuân Thiều 27 66,67 7,41 25,92 0 5 Chợ Ngọc Thụy 36 66,67 11,11 16,67 5,55 6 Chợ May 10 10 60 20 20 0 7 Chợ Lâm Du 18 44,45 22,22 33,33 0
Qua bảng 4.2 cho thấy thịt lợn là loại thịt được bày bán nhiều nhất, chiếm 44,45% - 66,67% số lượng thịt bày trong các chợ, cho thấy rằng nhu cầu tiêu dùng thịt lợn hàng ngày là rất lớn. Do thịt lợn là loại thịt có giá cả hợp lý, dễ sử dụng, dễ chế biến thành nhiều món ăn khác nhau phù hợp với nhu cầu của nguời tiêu dùng.
4.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM E. COLI VÀ SALMONELLA
TRONG THỊT LỢN TẠI MỘT SỐ CHỢ THUỘC QUẬN LONG BIÊN 4.2.1.Tình hình nhiễm vi khuẩn E. coli ở thịt lợn tại các chợ
Chúng tôi tiến hành lấy 68 mẫu thịt lợn tại các chợ như : Chợ Sài Đồng (10 mẫu), chợ Gia Lâm (10 mẫu), chợ Vủ Xuân Thiều (10 mẫu), chợ thương mại Ngọc Thụy (10 mẫu), chợ Diêm Gỗ ( 10 mẫu), chợ May 10 (9 mẫu), chợ Lâm Du ( 9 mẫu) để xác định số lượng vi khuẩn E. coli/1g thịt. Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli được trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra vi khuẩn E. coli trong các mẫu thịt lợn được lấy tại các chợ
STT Tên chợ Số mẫu kiểm tra Số Mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Không đạt Số mẫu Tỷ lệ (%) TCVS 1 Chợ Sài Đồng 10 8 80 4 40 ≤102 CFU/g 2 Chợ Gia Lâm 10 6 60 5 50 3 Chợ Vũ Xuân Thiều 10 7 70 4 40 4 Chợ Ngọc Thụy 10 6 60 4 40 5 Chợ Diêm Gỗ 10 6 60 2 20 6 Chợ May 10 9 6 66,67 1 11,11 7 Chợ Lâm Du 9 5 55,56 1 11,11 Tổng số 68 44 64,71 21 30,88
Ghi chú: TCVS: Tiêu chuẩn vệ sinh
Qua bảng 4.3 ta thấy: trong số 68 mẫu thịt được kiểm tra thì có 44 mẫu (64,71%) cho kết quả dương tính với E. coli, tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli tại các
chợ là khá cao. Điều đó phản ánh tình trạng vệ sinh tại các cơ sở giết mổ, các chợ cũng như vệ sinh vận chuyển còn kém. Tình trạng trên ảnh hưởng đến chất lượng vệ sinh thịt.
Trong 44 mẫu dương tính với vi khuẩn E. coli thì có 21 mẫu không đạt tiêu chuẩn vệ sinh (> 102 CFU/g) và 23 mẫu đạt tiêu chuẩn vệ sinh (≤102 CFU/g).
(chiếm 30,88%) không đạt tiêu chuẩn về vệ sinh thực phẩm, có 47 mẫu (chiếm 69,12%) đạt tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm. Qua đó cho thấy tỷ lệ nhiễm E. coli là khá cao so với chỉ tiêu cho phép, rất dễ gây ngộ độc thực phẩm cho
người tiêu dùng.
So sánh kết quả nghiên cứu này với các kết quả của một số tác giả đã nghiên cứu trước đó, kết quả nhiễm vi khuẩn E. coli trong nghiên cứu này thấp
hơn kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Tuyên (2017), đánh giá mức độ ô nhiễm vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh thực phẩm, đặc điểm sinh học của vi khuẩn E. coli trong thịt lợn tại tỉnh Điện Biên cho thấy có đến 68/90 mẫu thịt lợn nhiễm E. coli, chiếm tỷ lệ khoảng 75,56%, với 38 mẫu không đạt tiêu chuẩn vệ sinh chiếm 42,22%, và cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Lại Thị Lan Hương và Vũ Đức Hạnh (2017), đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật trên thịt ở một số cơ sở giết mổ lợn tại thành phố Thanh Hóa cho thấy có 20/67 mẫu không đạt tiêu chuẩn vệ sinh chiếm 29,85%, 70,15% số mẫu đạt tiêu chuẩn về giới hạn nhiễm E. coli.