2.2.1. Đặc tính sinh học
Trực khuẩn E. coli là một vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột
Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và động
vật máu nóng. Trong đường ruột, E. coli có nhiều ở ruột già nên còn gọi là vi
khuẩn ruột già. Từ ruột, E. coli theo phân ra đất, nước và khi gặp điều kiện phát triển thuận lợi, chúng có thể trở thành nguyên nhân gây ra một số bệnh ở người và động vật.
2.2.1.1. Hình thái
E. coli là một trực khuẩn Gram (-), hình gậy ngắn, kích thước 2-3 x 0,6µm.
Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có khi trong môi trường nuôi cấy thấy có những trực khuẩn dài 4-8µm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già. Mặc dù có lông nhưng một tỷ lệ lớn các E. coli không di động.Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô.
2.2.1.2. Đặc tính nuôi cấy
E. coli là vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện. Có thể phát triển dễ dàng
trên các môi trường nuôi cấy thông thường, ở nhiệt độ từ 5-40ºC, nhiệt thích hợp là 37ºC, pH 7,2-7,4 nhưng vẫn có thể phát triển trên môi trường có độ pH 5,5-8.
Nuôi cấy trên môi trường thạch thường: Sau 24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37ºC hình thành khuẩn lạc tròn, hơi lồi, ướt, bóng láng, không trong suốt màu
trắng tro nhạt, có đường kính khuẩn lạc 2-3 mm. Nếu nuôi lâu hơn, khuẩn lạc chuyển màu gần như màu nâu nhạt và mọc rộng ra. Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng M (Mucoid) và dạng R (Rough).
Trong môi trường nước thịt: Phát triển tốt, môi trường rất đục, có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối.
Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thước từ 1-2 mm, có thể có hoặc không có dung huyết (tùy thuộc vào chủng).
Môi trường thạch pepton: Vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn, ướt, màu xám, kích thước trung bình, mặt khuẩn lạc hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt bóng láng.
Môi trường MacConkey: Khuẩn lạc màu hồng, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
Môi trường EMB: Khuẩn lạc màu tím đen, có ánh kim màu xanh lá cây. Môi trường SS: Khuẩn lạc màu đỏ.
Môi trường BGA: khuẩn lạc dạng S, màu vàng nhạt.
2.2.1.3. Đặc tính sinh hoá và sức đề kháng
Các chủng E. coli đều lên men sinh hơi mạnh: glucose, galactose,
lactose, fructose, maltose, lên men nhưng không sinh hơi các loại đường: saccharose, ducitol.
Thử nhóm phản ứng sinh hoá IMVic cho kết quả (++--).
Cũng như các loại vi khuẩn không sinh nha bào khác, E. coli không chịu được nhiệt độ cao, đun 55ºC trong vòng 1h, 60ºC trong vòng 30 phút, đun sôi 100ºC chết ngay. Các chất sát trùng thông thường như: axit phenic 3%, foocmon, hydroperoxit 1% diệt vi khuẩn sau 5 phút. Tuy nhiên ở môi trường bên ngoài, các chủng E. coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Như
Thanh và cs., 1997).
2.2.2. Cấu trúc kháng nguyên
E. coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, bao gồm kháng nguyên thân
O, kháng nguyên lông H, kháng nguyên K, kháng nguyên bám dính F. Ngày nay, người ta phát hiện một cách nhanh chóng số lượng các kháng nguyên F. Chức năng của kháng nguyên này là giúp vi khuẩn bám giữ vào giá thể (màng
nhầy của đường tiêu hoá) hay còn gọi là bám dính. Yếu tố bám dính có vai trò quan trọng trong việc sản sinh ra độc tố đường ruột và kích thích cơ thể gia súc thực hiện đáp ứng miễn dịch. Phần lớn các chủng E. coli có kháng nguyên bám dính đều sản sinh độc tố (Vũ Khắc Hùng, 2005).
Có ít nhất 170 kháng nguyên O, 80 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H. Mỗi type kháng huyết thanh được ký hiệu bởi công thức kháng nguyên mà chúng có. Ví dụ: O139: K82: H1, O8: K88: H19
+ Kháng nguyên O (somatic):
Kháng nguyên O được cấu trúc bởi hợp chất lipopolysaccharide gồm 2 nhóm:
- Polysaccharide có nhóm hydro nằm ở thành ngoài có chức năng tạo ra
tính đặc trưng về serotype.
- Polysaccharide nằm bên trong không có nhóm hydro không mang tính
đặc trưng và chỉ tạo ra sự khác biệt về khuẩn lạc (từ dạng S sang R). Vì vậy sự thay đổi kháng nguyên O dẫn đến sự thay đổi về độc lực hoặc hình thái khuẩn lạc. Phần lipid quyết định tính độc lực của vi khuẩn.
Kháng nguyên O là loại kháng nguyên chịu nhiệt, không bị phá huỷ khi đun ở 1200C trong 2 giờ. Kháng nguyên O rất quan trọng trong độc lực và xác định
serotype của vi khuẩn E. coli. + Kháng nguyên H (flagella):
Kháng nguyên H có bản chất là protein, kém bền vững hơn kháng nguyên O, khả năng chịu nhiệt kém. Nếu gặp cồn 50% và các enzyme phân huỷ protein nó sẽ bị phá huỷ hoàn toàn. Xử lý bằng fomol 0,5%, kháng nguyên H vẫn tồn tại. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết. Tuy nhiên kháng nguyên H và O không phụ thuộc vào nhau trong quá trình đáp ứng miễn dịch. Vì vậy, khi tạo miễn dịch cho động vật bằng hai loại kháng nguyên dẫn đến hình thành cả hai loại kháng thể. Nhưng nồng độ ngưng kết của kháng thể H thường cao hơn nồng độ ngưng kết của kháng thể O. Kháng nguyên H không có vai trò độc lực của vi khuẩn và cũng không có ý nghĩa trong miễn dịch phòng vệ.
+ Kháng nguyên K(capsular):
Bản chất của kháng nguyên K là một polysaccharide, chúng bao quanh tế
bào vi khuẩn. Vai trò gây bệnh của kháng nguyên K không rõ ràng, tuy vậy chúng bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại các quá trình phòng vệ của vật chủ và giúp găn kháng nguyên pili vào tế bào biểu mô nhung mao ruột dễ dàng hơn.
Kháng nguyên Pili có bản chất là protein, nằm trong cấu trúc fimbriae trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Dưới kính hiển vi điện tử chúng có hình ảnh là những cấu trúc thẳng, ngắn hơn, lông nằm xung quanh bề mặt tế bào vi khuẩn. Trước đây nhóm kháng nguyên này được xếp trong nhóm kháng nguyên capsular về bản chất hoá học và cấu trúc. Do vậy, để tránh nhầm lẫn người ta gọi chúng là kháng nguyên pili hay fimbriae, ký hiệu là kháng nguyên F.
2.2.3. Đặc tính gây bệnh
Cơ chế gây ngộ độc: Khi cơ thể bị nhiễm một số vi khuẩn kèm theo độc tố của chúng.
E. coli gây bệnh được chia thành sáu nhóm như sau:
+ Enteropathogenic E .coli (EPEC): Là nhóm E. coli gây bệnh đường ruột. Gồm các type thường gặp O26: B6, O44, O55: B5, O112: B11, O124, O125: B5,
O142, thường gây tiêu chảy cho trẻ em dưới 18 tháng.
+ Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) - Verotoxin producing E .coli
(VTEC): gây xuất huyết ruột và tiết niệu do nhóm vi khuẩn sản sinh độc tố tế bào thường gây bệnh cho trẻ em dưới 5 tuổi.
+ Enteroodherent aggregative (EA - AggEC): Là nhóm vi khuẩn E. coli gây kết tập đường ruột.
+ Enterotoxigenic E. coli (ETEC): Là nhóm E. coli sản sinh độc tố đường
ruột (LT, ST), gây bệnh ở mọi lứa tuổi.
+ Enteroinvasive E. coli (EIEC): Là nhóm E. coli xâm nhập và kí sinh nội bào. Những E. coli thuộc nhóm này có 1 số đặc tính sinh hóa gần giống Shigella. 30% các chủng phân lập được không lên men lactose, đa số không di dộng. Thường gặp các type O125, O167, O144….
+ Necrosis E. coli: Là nhóm vi khuẩn gây hoại tử tế bào.
Gần đây người ta phát hiện chủng E. coli mới ký hiệu là E. coli O157: H7.
Chủng này đã gây ra những vụ ngộ độc lớn trên thế giới trong những năm gần đây.
2.4. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN SALMONELLA 2.4.1. Đặc tính sinh học 2.4.1. Đặc tính sinh học
Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae.
Giống Salmonella gồm 2 loài: S.enterica và S.bongori đã được phân chia thành
kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và đôi khi các kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K). Gần đây loài S.enterica đã được phân thành 6 phân loài, đó
là: S.enterica subsp. enterica, S.enterica subsp. salamae, S. enterica subsp.
arizonae, S.enterica subsp. houtenae, S.enterica subsp. diarizinae, S.enterica subsp. Indica (Letellier A.et al., 2009)
2.4.1.1. Hình thái
Salmonella có hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4-0,6 x 1-3 µm,
không hình thành giáp mô và nha bào. Đa số các loài Salmonella đều có khả
năng di động mạnh do có 7-12 lông (Flagella) xung quanh thân (trừ Salmonella
gallinarum, Salmonella pullorum). Vi khuẩn dễ nhuộm với các thuốc nhuộm
thông thường, Gram (-), khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu (Nguyễn Như Thanh, 1997).
2.4.1.2. Tính chất nuôi cấy
Salmonella phát triển trong điều kiện hiếu khí nhưng có thể phát triển trong
điều kiện yếm khí, trong môi trường hiếu khí mọc tốt hơn. Có rất nhiều môi trường dinh dưỡng chọn lọc được dung trong phân lập Salmonella.
Môi trường BSA: sau 48 giờ nuôi cấy ở 37ºC, vi khuẩn Salmonella mọc lên những khuẩn lạc đặc trưng, xung quanh khuẩn lạc màu nâu thẫm càng vào giữa khuẩn lạc càng đậm.
Môi trường thạch thường: Vi khuẩn Salmonella hình thành những khuẩn lạc lớn, đường kính trung bình 3-4 mm. Khuẩn lạc tròn, mặt hơi lồi, rìa và bề mặt nhẵn, láng bóng, cũng có khi có hình đĩa, rìa có khía răng cưa.
Môi trường BGA: vi khuẩn Salmonella thể hiện tính kiềm, hình thành
những khuẩn lạc màu đỏ.
Môi trường XLD: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đen do H2S được tạo ra từ phản ứng điển hình của Salmonella.
Môi trường TSI: vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc nhạt màu, mặt nghiêng môi trường có màu đỏ, màu hồng ở đáy cùng với sản sinh ra H2S làm cho môi trường có màu đen.
Môi trường MSRV: là môi trường chọn lọc những Salmonella có khả năng di động, vi khuẩn di động ra xung quanh môi trường tạo thành vòng màu trắng có thể quan sát được.
bóng, hơi lồi.
Môi trường Rambach: vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc trung bình, màu đỏ tím, bóng.
Môi trường Kligler: mặt nghiêng môi trường không đổi do vi khuẩn không lên men đường lactose, phần thạch đứng vi khuẩn đổi màu do vi khuẩn lên men đường glucose làm thay đổi pH môi trường và sinh H2S có màu đen.
Nhiệt độ nuôi cấy Salmonella thích hợp nhất cho vi khuẩn phát triển là 37ºC. Nhưng có thể phát triển được từ 6-42ºC, Nuôi cấy ở 43ºC vẫn phát triển được.
2.4.1.3. Đặc tính sinh hoá và sức đề kháng
Phần lớn Salmonella lên men sinh hơi glucose, mannit, mantose, galactose, tuy nhiên cũng có một số loài lên men các đường trên nhưng không sinh hơi như
S. abortus spp, S. typhisuis (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970). Tất cả các Salmonella
đều không lên men đường lactose, saccarose, đây là một đặc tính sinh hoá quan trọng góp phần để phân biệt Salmonella và E. coli.
Đa số Salmonella không làm tan chảy gelatin, không phân giải ure, không
sản sinh indole, một số sử dụng được carbon ở nguồn citrate, phân giải xanh methylene. Phản ứng MR (+), catalaza (+), sinh H2S.
Salmonella khó sinh sản trong nước thường nhưng có thể tồn tại một tuần,
trong nước đá có thể sống 2-3 tháng, trong xác động vật chết chôn trong bùn, cát có thể sống 2-3 tháng. Với nhiệt độ vi khuẩn có sức đề kháng yếu, ở 50ºC bị diệt sau 1h, 70ºC trong 20 phút, đun sôi trong 5 phút, khử khuẩn theo phương pháp Pasteur Salmonella cũng bị tiêu diệt. Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi
khuẩn sau 5 giờ ở nước trong và 9 giờ ở nước đục (Nguyễn Như Thanh, 1997).
Salmonella có thể sống từ 4-8 tháng trong thịt ướp muối có tỷ lệ muối là
20%, ở nhiệt độ 6-12ºC. Khi xử lý miếng thịt nhiễm trùng bằng hơ lửa hay nướng ít có tác dụng diệt Salmonella bên trong (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970).
2.4.2. Cấu trúc kháng nguyên
Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella hết sức phức tạp, bao gồm 3 loại chính:
Kháng nguyên O (O - Antigen): Kháng nguyên thân. Kháng nguyên H (H - Antigen): Kháng nguyên lông. Kháng nguyên K (K – Antigen): Kháng nguyên vỏ.
+ Kháng nguyên thân O (O – Antigen)
Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoài của thành tế bào vi khuẩn gram âm. Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat-stable) và kháng cồn, bị biến tính khi xử lý bằng formaldehyde. Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chính:
- Polysaccharid không có nhóm hydro, không mang tính đặc trưng của kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S sang dạng R và dẫn đến giảm độc lực của vi khuẩn (Kishima et al.,2008).
- Polysaccharid nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết định tính kháng nguyên và đặc trưng cho từng serotyp.
Kháng nguyên O được xem như là một nội độc tố (Endotoxin) mà nó được cấu tạo bởi nhóm hỗn hợp glyco – polypeptid có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn.
+ Kháng nguyên H (H – Antigen)
Kháng nguyên H là protein nằm trong thành phần lông của vi khuẩn, là loại kháng sinh không chịu nhiệt, rất kém bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt độ 60ºC, dễ bị phá hủy bởi cồn và axit.
Kháng nguyên H gồm có 2 phase:
-Phase 1: có tính đặc hiệu, gồm 28 loại kháng nguyên được biểu thị bằng chữ mẫu La Tinh thường: a, b, c, d,…, z.
-Phase 2: không có tính đặc hiệu, gồm 6 loại được biểu thị bằng chữ số Ả Rập: 1, 2, 3, 4, 5, 6 hay La Tinh thường: e, n, x,…
Kháng nguyên H không quyết định yếu tố độc lực của vi khuẩn, cũng như không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, nhưng nó có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định giống loài của vi khuẩn.
+ Kháng nguyên vỏ K (K – Antigen) (hay Vi – Antigen)
Kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như S.typhi, S.paratyphi, S.dublin
cũng có thể mang kháng nguyên vỏ. Kháng nguyên K có thể làm che các kháng nguyên thân O (Quinn, 2004), nếu đun sôi huyễn dịch của các loài Salmonella
này trong 10 đến 12 phút sẽ phá hủy đc kháng nguyên vỏ.
Bản chất hoá học của kháng nguyên K là polysaccharide. Kháng nguyên K có hai nhiệm vụ chính:
cùng kháng nguyên O trong cấu trúc.
- Tạo thành hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào.
Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết kháng thể O khi phát triển nhiều. Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotype là: S.typhi và
S.paratyphi C. Ký hiệu kháng nguyên Vi trong công thức kháng nguyên thường
đứng sau kháng nguyên O. Theo sơ đồ của Kauffmann – White, công thức kháng nguyên của S.paratyphi C là: 6,7, Vi: -1,5 và S.typhi là: 9, 12, Vi: c, d.
Trong 3 kháng nguyên chủ yếu trên, kháng nguyên O và kháng nguyên H là 2 loại kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán.
2.4.3. Yếu tố gây bệnh
2.4.3.1. Các yếu tố không phải là độc tố
Các yếu tố gây bệnh là những tác nhân gián tiếp thì quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, còn các yếu tố gây bệnh là độc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết định quá trình sinh bệnh.
2.4.3.2. Các yếu tố là độc tố
Các yếu tố gây bệnh là độc tố của Salmonella bao gồm: nội độc tố (Endotoxin), ngoại độc tố đường ruột (Enterotoxin) và độc tố tế bào (Cytotoxin).
+ Độc tố đường ruột (Enterotoxin)
Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: Độc tố thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và độc tố thẩm xuất chậm DPF (Delayed Permeability Factor).
Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli (Heat-stabile toxin: ST).
Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hóa lớp tế bào villi của thành ruột, gây tiêu chảy.
Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột, và thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1-2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương