Quả cành hình thành chìm trong mô, hình cầu, hình gần cầu hoặc elip. Quả cành có kích thước 120 – 240 × 125 - 225 µm; vách quả cành bao gồm nhiều lớp, dày 25 - 70 µm, màu nâu nhạt đến nâu, là sự sắp xếp dày đặt của các tế bào rắn chắc có dạng hình cầu; bên trong vách bao gồm 1 - 2 lớp tế bào màu nâu nhạt, dần trở thành trong suốt về phía bên trong. Có một miệng nhỏ, ở giữa, rộng 7 - 8 µm, sâu 30 - 32 µm, mặt cắt có hình trụ, bao gồm các tế bào dày, có màu nâu sẫm. Bào tử đơn bào, trong suốt, không có vách ngăn, vách mỏng và mịn, hình elip đến dạng trứng ngược, thon dần về phía đuôi, kích thước 10 – 16 × 5 - 8 µm. Bên ngoài bào tửđược bao bọc bằng một lớp màng nhầy mỏng, dày 1 µm và màu trong trong suốt. Chất nhầy còn tạo thành phụ bộ có hình trụ, kích thước 7 – 14 × 1 - 2 µm, thẳng đến linh hoạt, không phân nhánh, nhọn về một hướng (Wang et al., 2012; Wulandari et al., 2009).
Đặc điểm tản nấm trên môi trường nuôi cấy: Trên môi trường MEA: Sợi nấm mọc sát môi trường, đều, kết thành một khối. Bề mặt màu xám chì ở trung tâm, rìa tản nấm có màu xám nâu hơi xanh và màu đen chì ở mặt dưới. Trên môi trường PDA, nấm mọc sát môi trường, lan rộng, rìa tản nấm với những sợi nấm mỏng, mịn. Bề mặt tản nấm màu xanh xám đen ở trung tâm, màu xám nhạt ở phần rìa và mặt dưới màu xanh đen và màu xanh lục vàng. Trên môi trường CMA, nấm mọc sát môi trường và không đều với rìa tản nấm dạng thùy. Bề mặt tản nấm màu xanh đen ở trung tâm, màu cám nhạt ở rìa và màu đen chì ở bên dưới tản nấm. Trên môi trường OA, nấm mọc sát môi trường và mọc không đều với rìa là những sợi nấm mảnh, mịn. Bề mặt tản nấm màu đen chì ở trung tâm, màu lục vàng ở rìa và màu đen chì đến màu xám ở mặt dưới tản nấm ((Wang et al., 2012; Wulandari et al., 2009).
Ở nhiệt độ tối ưu: Sau hai tuần tốc độ tăng trưởng tối ưu đã được quan sát thấy ở nhiệt độ 30 0C trên môi trường MEA, CMA và OA ( 22mm), trên môi trường PDA xảy ra ở nhiệt độ 27 0C ( 43 mm). Tốc độ tăng trưởng tối thiểu được quan sát thấy ở nhiệt độ 15 0C trên môi trường MEA ( 5mm), PDA ( 15mm), CMA ( 5mm) và OA ( 6mm). Tốc độ tăng trưởng cao nhất là ở nhiệt độ 33 0C trên môi trường MEA, CMA và OA ( 17mm), trên môi trường PDA xảy ra ở nhiệt độ 36 0C ( 3,5mm) (Wang et al., 2012; Wulandari et al., 2009).
Theo Wulandari et al., (2009) loài P. citriasiana khác với hai loài gây hại trên cây có múi ở kích thước bào tử vô tính, đặc điểm môi trường và yêu cầu nhiệt độ tối ưu để nấm phát triển. Loài P. citriasiana có kích thước bào tử lớn hơn so với loài Guignardia citricarpa và cho đến nay chỉ biết đến từ trạng thái của nó. Các vỏ bào tử vô tính là trung gian giữa loài G. citricarpa và loài G. mangiferae. Các vỏ này khá mỏng, giống loài G. citricarpa và dày hơn loài G. mangiferae. Trong môi trường tản nấm cũng sẫm màu hơn so với hai loài khác là màu xám chì đến đen trong tất cả các môi trường đã được kiểm tra. Nhiệt độ tối đa cho sự tăng trưởng xảy ra ở 30 – 33 0C, trong khi đối với loài G. citricarpa và loài G. mangiferae là ở 30 – 36 0C. Loài P. citriasiana có thểđược phân biệt với loài G. citricarpa là loài P. citriasiana không sản xuất sắc tố màu vàng trên môi trường OA còn loài G. citricarpa sản xuất sắc tố màu vàng trên môi trường OA (Wang et al., 2012; Wulandari et al., 2009).
Sự phát sinh loài P. citriasiana có thể được phân biệt với hai loài G. citricarpa và loài G. mangiferae dựa trên ba vùng gien trình tự. Giữa loài P. citriasiana và loài G. citricarpa có 12 thay đổi nucleotide cố định và 1 indel đã được quan sát trên 602 nucleotide, trong khi TEF1 chứa 7 thay đổi nucleotide cố định và 2 indels hơn 271 nucleotide và ACT chỉ có 2 thay đổi nucleotide cốđịnh trên 257 nucleotide (Wulandari et al., 2009).
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Đối tượng nghiên cứu: Nghiên cứu bệnh đốm nâu do nấm P. citriasiana
trên cây có múi.
- Thời gian: Từ tháng 02 năm 2015 đến tháng 4 năm 2016 - Địa điểm:
+ Tại một số vườn trồng cây có múi chính của tỉnh: Huyện Tân Lạc, huyện Cao Phong, huyện Yên Thủy.
+ Tại Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Điều tra tình hình bệnh đốm nâu gây hại cây có múi tại tỉnh Hòa Bình
- Điều tra mức độ nhiễm bệnh đốm quả tại các khu vực trồng cây có múi chính tại tỉnh Hòa Bình.
- Điều tra mức độ nhiễm bệnh đốm quả tại các cây có múi chính ( cam, quýt, bưởi).
- Xác định sự phát sinh, phát triển bệnh (theo thời gian).
3.2.2. Nghiên cứu vềđặc điểm hình thái nấm đốm nâu P. citriasiana
- Phân lập (5-10 mẫu) và đánh giá đặc điểm hình thái (tản nấm, bào tử) của nấm gây bệnh.
- Đo kích thước vết bệnh trên quả của một số loại cây có múi ( cam, chanh, bưởi).
3.2.3. Nghiên cứu về sinh học nấm đốm nâu P. citriasiana
- Nghiên cứu sự nảy mầm của bào tử nấm, phương thức xâm nhập và gây bệnh trên cây cam, quýt
- Mức độ nhiễm bệnh trên các giống cây có múi - Mức độ nhiễm trên các bộ phận cây ( lá, quả,...)
- Xác định nguồn bệnh trên tàn dư
3.2.4. Nghiên cứu về phòng trừ nấm đốm nâu P. citriasiana
- Đánh giá ảnh hưởng của một số loại thuốc hóa học đến khả năng ức chế nảy mầm bào tử của nấm.
- Đánh giá hiệu quả của một số loại thuốc hóa học trên IN VITRO ( thuốc Score 250EC, Carbenzim 500FL và thuốc Dipomate 80WP).
- Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh trên cây bằng thuốc hóa học ( thuốc Score 250EC, Carbenzim 500FL và thuốc Dipomate 80WP).
3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Một số giống cây ăn quả có múi: (Bưởi đỏ, bưởi da xanh, bưởi diễn, cam CS1,...) trên địa bàn các huyện Tân Lac, Cao Phong, Yên Thủy.
- Môi trường nuôi cấy: PDA, PCA
- Các vật dụng và thiết bị cơ bản cần cho nghiên cứu nấm (hình thái và sinh học) + Quả bưởi + Kính soi nổi + Kính hiển vi quang học. + Cồn 700 + Nước cất thanh trùng
- Các vật dụng, hóa chất, thiết bị cần cho nghiên cứu phân tử - Các vật dụng cần cho thí nghiệm đồng ruộng
+ Thuốc BVTV: Score 250EC, Carbenzim 500FL, Dipomate 80WP. + Bình phun thuốc.
- Các hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm: Agar, đường Glucose, cồn 700, cồn 960, nước cất, nước cất vô trùng, thuốc trừ bệnh cây (thuốc Score 250EC, Carbenzim 500FL, thuốc Dipomate 80WP, Isacop 65,2WG, Topan 70WP, Nativo 750WG, Amistar top 325SC.
- Các giống cây sử dụng để đánh giá tính gây bệnh: Bưởi Diễn, bưởi da xanh, bưởi đỏ và một số giống cam.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phương pháp điều tra đồng ruộng 3.4.1. Phương pháp điều tra đồng ruộng
- Địa điểm điều tra: Điều tra tại những vùng trồng chính như: Cao Phong, Tân Lạc và Yên Thủy
- Phương pháp điều tra: Điều tra theo QCVN 01-38:2010/BNNPTNT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng và QCVN 01-119-2012-BNNPTNT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại trên cây ăn quả có múi.
Điều tra định kỳ 7 ngày/ lần tại khu vực điều tra cốđịnh. Tại khu vực điều tra, điều tra 10 điểm theo đường chéo, điểm điều tra cách mép vườn 1 hàng cây. Mỗi điểm điều tra 1 cây, mỗi cây điều tra 4 hướng, mỗi hướng chọn 1 cành nằm ở tầng giữa tán cây đểđiều tra. Đếm số quả/lá bị bệnh trên tổng số quả/lá của các cành để xác định tỷ lệ bệnh.
Bảng mức độ bệnh được đánh giá theo Aubert, 1994
Cấp độ bệnh Số lượng quả/lá trong vườn bị nhiễm bênh 0 Không bệnh + Bệnh ≤ 5 % ++ Bệnh từ >5 – 25 % +++ Bệnh từ >25 – 50 % ++++ Bệnh từ >50 – 75 % +++++ Bệnh > 75 % 3.4.2. Phương pháp thu thập mẫu
Phương pháp thu thập mẫu: Theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (Đặng Vũ Thị Thanh, Hà Minh Trung, 1997).
Tiến hành thu mua mẫu bệnh tại các vườn cây có múi ( bưởi, cam, chanh) ở các huyện Cao Phong, Tân Lạc và Yên Thủy của tỉnh Hòa Bình. Các mẫu bưởi thu vềđược bọc nilon và lưu giữở nhiệt độở 25 0C cho đến khi quan sát.
Các quả bưởi được thu là bưởi có những triệu chứng đốm quả thể hiện rõ trên bề mặt vỏ quả, số lượng đốm xuất hiện trên quả bưởi phải tương đối nhiều.
3.4.3. Phương pháp điều chế môi trường
- Môi trường PDA (Potato Glucose Agar) Thành phần:
+ Khoai tây: 200 gram + Agar: 20 gram + Glucose: 20 gram + Nước cất: 1000 ml
Cách điều chế môi trường PDA: Khoai tây gọt sạch vỏ, cân đủ lượng cần dùng ( 200 gram), rửa sạch, thái nhỏ ( 1 x 1 cm) đun với lượng nươc cất đã tính ( 1000 ml) đun sôi trong thời gian 20 phút. Bỏ ra, gạn lọc lấy dịch trong, thêm cho đủ nước ( 1000 ml) rồi đun sôi trở lại, cho từ từđường Glucose, Agar khấy đều và đun sôi cho đến khi tan Agar. Sau đó đổ môi trường đã nấu vào bình tam giác ( đã rửa sạch và vô trùng). Đem bình tam giác chứa môi trường hấp khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 0C ( tương đương với áp suất 5 atm) trong vòng 30 phút.
- Môi trường PCA ( Potato Carrot Agar) Thành phần:
+ Khoai tây: 20 gram + Cà rốt: 20 gram + Agar: 20 gram + Nước cất: 1000 ml
- Cách điều chế môi trường PCA: Tương tự như môi trường PDA
3.4.4. Phương pháp phân lập nấm
Phân lập nấm được tiến hành theo Nguyễn Văn Tuất (2002).
Phân lập: Chọn vết bệnh làm trung tâm, cắt một phần mô bưởi xung quanh dạng hình vuông cạnh 5mm, dày 3mm (dùng dao mổ cắt miếng nhỏ bao gồm cả phần bị bệnh và phần không bị bệnh), sau đó cắt chia ra hai phần bằng nhau. Cho mẫu vào ngâm trong cồn 700 khoảng 3 phút, rửa lại với nước cất thanh trùng hai
lần, sau đó để lên giấy thấm thanh trùng cho ráo nước hoàn toàn, cho mẫu vào đĩa petri chứa môi trường WA, 4 mẫu/đĩa. Mẫu phân lập được đểở 25 0C, sau 4 - 5 ngày khi những tản nấm màu đen, rìa màu trắng phát triển thì tiến hành tách ròng sang môi trường PDA. Môi trường PDA là môi trường giàu dinh dưỡng gồm: Khoai tây, đường Dextrose và thạch Agar.
Làm thuần mẫu: Làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử hay đỉnh sinh trưởng sợi nấm theo phương pháp của Burgess và cs. (2009). Cất trữ nguồn nấm để thực hiện các thí nghiệm kế tiếp. Quan sát sự phát triển của tản nấm trên môi trưởng PDA, ghi nhận các chỉ tiêu như màu sắc, cách mọc trên môi trường, tiến hành đo đường kính của tản nấm trên môi trường PDA ở thời điểm 14 ngày sau khi nuôi cấy.
3.4.5. Phương pháp lây nhiễm kèm các chỉ tiêu đánh giá
Phương pháp lây nhiễm tiến hành theo Lester W. Burgess (2008). Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo được thực hiện ở 2 phương pháp lây là có sát thương và không có sát thương. Thí nghiệm được tiến hành như sau:
Chuẩn bị nguồn bệnh: Nguồn bệnh là bào tử phân sinh được lấy từ quả cành trên vết bệnh trên quả. Quả cành trên vết bệnh được lấy cho vào ống effpendorf chứa nước cất để giải phóng bào tử phân sinh. Nồng độ bào tử phân sinh được điều chỉnh đạt nồng độ 105 bào tử/ml.
3.4.5.1.Thí nghiệm lây nhiễm trên quả
Chọn 9 quả bưởi có 3 tuổi trong đó có 3 quả non, 3 quả trưởng thành và 3 quả chín, kích thước tương đối đồng đều và quan trọng là không có xuất hiện những đốm bệnh trên vỏ quả. Các quả bưởi được rửa sạch bụi đất với nước sau đó thanh trùng bề mặt bằng cách ngâm trong cồn 700 khoảng 2 phút.
Tiến hành lây bệnh nhân tạo:
- Lây nhiễm trong phòng thí nghiệm: Lây nhiễm được tiến hành trên 3 dạng tuổi của quả bưởi ( quả non, quả trưởng thành và quả chín) với 3 lần nhắc lại. Trên mỗi một quả bưởi tiến hành lây theo 2 kiểu: Kiểu 1 dùng pipet nhỏ trực tiếp 20 µl dung dịch bào tử nấm lên bề mặt quả ( không tạo vết thương), kiểu 2 dùng que kim tạo 5 vết thương trên bề mặt quả sau đó nhỏ 20 µl dung dịch bào tử nấm lên bề mặt quả đã tạo vết thương. Sau đó đặt những quả bưởi bên trong hộp
ẩm. Để quảở nhiệt độ khoảng 25 – 28 0C và ủ tối trong ba ngày đầu. Theo dõi sự biểu hiện triệu chứng trong vòng 1 tháng.
- Lây nhiễm ngoài đồng ruộng: Trên một cây bưởi chọn 9 quả với 3 dạng tuổi, mỗi dạng tuổi 3 quả ( quả non, quả trưởng thành, quả chín), rửa sạch sau đó thanh trùng bằng cồn 700 trong khoảng 2 phút. Trên mỗi quả bưởi tiến hành lây nhiễm theo 2 kiểu: Kiểu 1 sử dụng miếng bông cán mỏng có kích thước 2 x 2 cm thấm dung dịch bào tử nấm và dán lên bề mặt quả bưởi bằng băng dính trắng, kiểu 2 dùng que kim tạo 5 vết thương sau đó dùng miếng bông cán mỏng kích thước 2 x 2 cm có thấm dung dịch bào tử nấm và dán lên bề mặt quả bưởi bằng băng dính trắng. Sau khi lây nhiễm xong dùng nilon bọc lại giữ ẩm độ trong quả trong 3 ngày đầu. Theo dõi sự biểu hiện triệu chứng trong vòng 1 tháng.
3.4.5.2.Lây nhiễm trên lá
Phương pháp lây nhiễm trên lá cũng được tiến hành giống như lây nhiễm trên quả. Thí nghiệm cũng được thực hiện trên 3 loại lá (lá non, lá bánh tẻ và lá già).
3.4.6. Phương pháp và các chỉ tiêu hình thái cần đánh giá
3.4.6.1. Triệu chứng vết bệnh
Quan sát tác nhân gây bệnh dưới kính soi nổi: Ghi nhận màu sắc bên trong, rìa vết bệnh, cách mọc của quả cành trong vết bệnh và chụp hình ghi nhận.
Quan sát dưới kính hiển vi: Tiến hành phẩu thức vết bệnh và quan sát dưới kính hiển vi để mô tả hình dạng, màu sắc của quả cành, bào tử, ghi nhận kích thước (tiến hành đo ngẫu nhiên kích thước của 20 quả cành và 30 bào tử dưới kính hiển vi quang học ở vật kính X40, sau đó lấy trung bình), chụp hình.
3.4.6.2. Kích thước vết bệnh trên quả của một số loại cây có múi
Chọn những quả có múi (cam, chanh, bưởi) có triệu chứng vết bệnh điển hình, sau đó trên những loại quả cắt những vết bệnh đo trên thước panme có sai số 0,01 mm. Tiến hành đo mỗi loại quả cây có múi 30 vết bệnh và xử lý số liệu kích thước vết bệnh trên excel 2003.
3.4.6.3. Xác định nguồn bệnh trên tàn dư lá cây
Phương pháp xác định nguồn bệnh trên tàn dư lá được thực hiện theo Truter, 2010. Thu thập những lá tàn dư trên vườn bị nhiễm bệnh nặng sau đó xác định nguồn bệnh trên tàn dư lá bằng 2 phương pháp:
- Phương pháp xác định nguồn bệnh trực tiếp trên lá: Lựa chọn 3 lá khô có ổ nấm trên bề mặt lá, mỗi lá quan sát 30 ổ nấm trên kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần để xác định nguồn bệnh.
- Phương pháp xác định nguồn bệnh trên lá tàn dư ẩm: Lựa chọn các lá thải có ổ nấm trên bề mặt lá, sau đó khử trùng bằng cồn 700 trong 3 phút, rửa sạch bằng nước cất thanh trùng, cho mẫu lá vào hộp nhựa giữ ẩm. Quan sát nguồn bệnh trong 24 giờ và 7 ngày sau khi giữẩm.
3.4.7. Phương pháp nghiên cứu các chỉ tiêu sinh học
3.4.7.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của bề mặt giá thể tới nảy mầm và hình thành
đĩa áp của nấm
Thí nghiệm được tiến hành theo Shaw et al., 2006; Shaw et al., 1998: Chuẩn bị vật liệu: Bào tử phân sinh được thu thập từ các vết bệnh trên quả, sau đó rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng. Bề mặt giá thể gồm có bề mặt ghét