- Địa điểm điều tra: Điều tra tại những vùng trồng chính như: Cao Phong, Tân Lạc và Yên Thủy
- Phương pháp điều tra: Điều tra theo QCVN 01-38:2010/BNNPTNT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng và QCVN 01-119-2012-BNNPTNT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại trên cây ăn quả có múi.
Điều tra định kỳ 7 ngày/ lần tại khu vực điều tra cốđịnh. Tại khu vực điều tra, điều tra 10 điểm theo đường chéo, điểm điều tra cách mép vườn 1 hàng cây. Mỗi điểm điều tra 1 cây, mỗi cây điều tra 4 hướng, mỗi hướng chọn 1 cành nằm ở tầng giữa tán cây đểđiều tra. Đếm số quả/lá bị bệnh trên tổng số quả/lá của các cành để xác định tỷ lệ bệnh.
Bảng mức độ bệnh được đánh giá theo Aubert, 1994
Cấp độ bệnh Số lượng quả/lá trong vườn bị nhiễm bênh 0 Không bệnh + Bệnh ≤ 5 % ++ Bệnh từ >5 – 25 % +++ Bệnh từ >25 – 50 % ++++ Bệnh từ >50 – 75 % +++++ Bệnh > 75 % 3.4.2. Phương pháp thu thập mẫu
Phương pháp thu thập mẫu: Theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (Đặng Vũ Thị Thanh, Hà Minh Trung, 1997).
Tiến hành thu mua mẫu bệnh tại các vườn cây có múi ( bưởi, cam, chanh) ở các huyện Cao Phong, Tân Lạc và Yên Thủy của tỉnh Hòa Bình. Các mẫu bưởi thu vềđược bọc nilon và lưu giữở nhiệt độở 25 0C cho đến khi quan sát.
Các quả bưởi được thu là bưởi có những triệu chứng đốm quả thể hiện rõ trên bề mặt vỏ quả, số lượng đốm xuất hiện trên quả bưởi phải tương đối nhiều.
3.4.3. Phương pháp điều chế môi trường
- Môi trường PDA (Potato Glucose Agar) Thành phần:
+ Khoai tây: 200 gram + Agar: 20 gram + Glucose: 20 gram + Nước cất: 1000 ml
Cách điều chế môi trường PDA: Khoai tây gọt sạch vỏ, cân đủ lượng cần dùng ( 200 gram), rửa sạch, thái nhỏ ( 1 x 1 cm) đun với lượng nươc cất đã tính ( 1000 ml) đun sôi trong thời gian 20 phút. Bỏ ra, gạn lọc lấy dịch trong, thêm cho đủ nước ( 1000 ml) rồi đun sôi trở lại, cho từ từđường Glucose, Agar khấy đều và đun sôi cho đến khi tan Agar. Sau đó đổ môi trường đã nấu vào bình tam giác ( đã rửa sạch và vô trùng). Đem bình tam giác chứa môi trường hấp khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 0C ( tương đương với áp suất 5 atm) trong vòng 30 phút.
- Môi trường PCA ( Potato Carrot Agar) Thành phần:
+ Khoai tây: 20 gram + Cà rốt: 20 gram + Agar: 20 gram + Nước cất: 1000 ml
- Cách điều chế môi trường PCA: Tương tự như môi trường PDA
3.4.4. Phương pháp phân lập nấm
Phân lập nấm được tiến hành theo Nguyễn Văn Tuất (2002).
Phân lập: Chọn vết bệnh làm trung tâm, cắt một phần mô bưởi xung quanh dạng hình vuông cạnh 5mm, dày 3mm (dùng dao mổ cắt miếng nhỏ bao gồm cả phần bị bệnh và phần không bị bệnh), sau đó cắt chia ra hai phần bằng nhau. Cho mẫu vào ngâm trong cồn 700 khoảng 3 phút, rửa lại với nước cất thanh trùng hai
lần, sau đó để lên giấy thấm thanh trùng cho ráo nước hoàn toàn, cho mẫu vào đĩa petri chứa môi trường WA, 4 mẫu/đĩa. Mẫu phân lập được đểở 25 0C, sau 4 - 5 ngày khi những tản nấm màu đen, rìa màu trắng phát triển thì tiến hành tách ròng sang môi trường PDA. Môi trường PDA là môi trường giàu dinh dưỡng gồm: Khoai tây, đường Dextrose và thạch Agar.
Làm thuần mẫu: Làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử hay đỉnh sinh trưởng sợi nấm theo phương pháp của Burgess và cs. (2009). Cất trữ nguồn nấm để thực hiện các thí nghiệm kế tiếp. Quan sát sự phát triển của tản nấm trên môi trưởng PDA, ghi nhận các chỉ tiêu như màu sắc, cách mọc trên môi trường, tiến hành đo đường kính của tản nấm trên môi trường PDA ở thời điểm 14 ngày sau khi nuôi cấy.
3.4.5. Phương pháp lây nhiễm kèm các chỉ tiêu đánh giá
Phương pháp lây nhiễm tiến hành theo Lester W. Burgess (2008). Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo được thực hiện ở 2 phương pháp lây là có sát thương và không có sát thương. Thí nghiệm được tiến hành như sau:
Chuẩn bị nguồn bệnh: Nguồn bệnh là bào tử phân sinh được lấy từ quả cành trên vết bệnh trên quả. Quả cành trên vết bệnh được lấy cho vào ống effpendorf chứa nước cất để giải phóng bào tử phân sinh. Nồng độ bào tử phân sinh được điều chỉnh đạt nồng độ 105 bào tử/ml.
3.4.5.1.Thí nghiệm lây nhiễm trên quả
Chọn 9 quả bưởi có 3 tuổi trong đó có 3 quả non, 3 quả trưởng thành và 3 quả chín, kích thước tương đối đồng đều và quan trọng là không có xuất hiện những đốm bệnh trên vỏ quả. Các quả bưởi được rửa sạch bụi đất với nước sau đó thanh trùng bề mặt bằng cách ngâm trong cồn 700 khoảng 2 phút.
Tiến hành lây bệnh nhân tạo:
- Lây nhiễm trong phòng thí nghiệm: Lây nhiễm được tiến hành trên 3 dạng tuổi của quả bưởi ( quả non, quả trưởng thành và quả chín) với 3 lần nhắc lại. Trên mỗi một quả bưởi tiến hành lây theo 2 kiểu: Kiểu 1 dùng pipet nhỏ trực tiếp 20 µl dung dịch bào tử nấm lên bề mặt quả ( không tạo vết thương), kiểu 2 dùng que kim tạo 5 vết thương trên bề mặt quả sau đó nhỏ 20 µl dung dịch bào tử nấm lên bề mặt quả đã tạo vết thương. Sau đó đặt những quả bưởi bên trong hộp
ẩm. Để quảở nhiệt độ khoảng 25 – 28 0C và ủ tối trong ba ngày đầu. Theo dõi sự biểu hiện triệu chứng trong vòng 1 tháng.
- Lây nhiễm ngoài đồng ruộng: Trên một cây bưởi chọn 9 quả với 3 dạng tuổi, mỗi dạng tuổi 3 quả ( quả non, quả trưởng thành, quả chín), rửa sạch sau đó thanh trùng bằng cồn 700 trong khoảng 2 phút. Trên mỗi quả bưởi tiến hành lây nhiễm theo 2 kiểu: Kiểu 1 sử dụng miếng bông cán mỏng có kích thước 2 x 2 cm thấm dung dịch bào tử nấm và dán lên bề mặt quả bưởi bằng băng dính trắng, kiểu 2 dùng que kim tạo 5 vết thương sau đó dùng miếng bông cán mỏng kích thước 2 x 2 cm có thấm dung dịch bào tử nấm và dán lên bề mặt quả bưởi bằng băng dính trắng. Sau khi lây nhiễm xong dùng nilon bọc lại giữ ẩm độ trong quả trong 3 ngày đầu. Theo dõi sự biểu hiện triệu chứng trong vòng 1 tháng.
3.4.5.2.Lây nhiễm trên lá
Phương pháp lây nhiễm trên lá cũng được tiến hành giống như lây nhiễm trên quả. Thí nghiệm cũng được thực hiện trên 3 loại lá (lá non, lá bánh tẻ và lá già).
3.4.6. Phương pháp và các chỉ tiêu hình thái cần đánh giá
3.4.6.1. Triệu chứng vết bệnh
Quan sát tác nhân gây bệnh dưới kính soi nổi: Ghi nhận màu sắc bên trong, rìa vết bệnh, cách mọc của quả cành trong vết bệnh và chụp hình ghi nhận.
Quan sát dưới kính hiển vi: Tiến hành phẩu thức vết bệnh và quan sát dưới kính hiển vi để mô tả hình dạng, màu sắc của quả cành, bào tử, ghi nhận kích thước (tiến hành đo ngẫu nhiên kích thước của 20 quả cành và 30 bào tử dưới kính hiển vi quang học ở vật kính X40, sau đó lấy trung bình), chụp hình.
3.4.6.2. Kích thước vết bệnh trên quả của một số loại cây có múi
Chọn những quả có múi (cam, chanh, bưởi) có triệu chứng vết bệnh điển hình, sau đó trên những loại quả cắt những vết bệnh đo trên thước panme có sai số 0,01 mm. Tiến hành đo mỗi loại quả cây có múi 30 vết bệnh và xử lý số liệu kích thước vết bệnh trên excel 2003.
3.4.6.3. Xác định nguồn bệnh trên tàn dư lá cây
Phương pháp xác định nguồn bệnh trên tàn dư lá được thực hiện theo Truter, 2010. Thu thập những lá tàn dư trên vườn bị nhiễm bệnh nặng sau đó xác định nguồn bệnh trên tàn dư lá bằng 2 phương pháp:
- Phương pháp xác định nguồn bệnh trực tiếp trên lá: Lựa chọn 3 lá khô có ổ nấm trên bề mặt lá, mỗi lá quan sát 30 ổ nấm trên kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần để xác định nguồn bệnh.
- Phương pháp xác định nguồn bệnh trên lá tàn dư ẩm: Lựa chọn các lá thải có ổ nấm trên bề mặt lá, sau đó khử trùng bằng cồn 700 trong 3 phút, rửa sạch bằng nước cất thanh trùng, cho mẫu lá vào hộp nhựa giữ ẩm. Quan sát nguồn bệnh trong 24 giờ và 7 ngày sau khi giữẩm.
3.4.7. Phương pháp nghiên cứu các chỉ tiêu sinh học
3.4.7.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của bề mặt giá thể tới nảy mầm và hình thành
đĩa áp của nấm
Thí nghiệm được tiến hành theo Shaw et al., 2006; Shaw et al., 1998: Chuẩn bị vật liệu: Bào tử phân sinh được thu thập từ các vết bệnh trên quả, sau đó rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng. Bề mặt giá thể gồm có bề mặt ghét nước là nhựa Polystyren (bản ELISA) và bề mặt ưa nước là thủy tinh (lam kính).
Tiến hành nhỏ 5 µl dịch bào tử chuẩn bị trong nước cất (~106 bào tử/ml) trên bề mặt vật liệu thí nghiệm. Tiếp theo đem vật liệu thí nghiệm để trong hộp ẩm độ bão hòa để ở nhiệt độ 30 0C, trong tối. Quan sát 100 bào tử/ công thức vật liệu sau 24 giờ.
3.4.7.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến nảy mầm và hình thành đĩa áp của nấm
Thí nghiệm được tiến hành theo Korf, 1998; Shaw et al., 2006; Shaw et al., 1998:
Chuẩn bị vật liệu: Bào tử phân sinh được thu thập từ các vết bệnh trên quả, sau đó rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng. Tiến hành nhỏ 5 µl dịch bào tử chuẩn bị trong nước cất (~105-6 bào tử/ml) trên bề mặt 3 bản ELISA. Các bản ELISA được để trong hộp ẩm bão hòa ở các nhiệt độ 25 0C, 30 0C, 35 0C và trong bóng tối. Quan sát 100 bào tử/ công thức nhiệt độ sau 24 giờ.
3.4.7.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất tới nảy nầm và hình thành đĩa áp của nấm
Thí nghiệm được thực hiện theo Shaw et al., 2000: - Chuẩn bị vật liệu:
+ Bào tử phân sinh được thu thập từ các vết bệnh trên quả, sau đó rửa 2 lần bằng nước cất vô trùng.
+ Cơ chất bao gồm: Ca2+ ( CaCl2 12mM); NPGM (Glucose 0.006% + NH4NO3 0,04 mM + K2HPO4 0.01 mM + MgSO4.7 H20 0.004 mM); Dịch triết cam Vinh ( Pha 2% trong nước cất, pH = 4); Dịch triết chanh ( Pha 2% trong nước cất, pH = 4); Dịch triết bưởi Diễn (Pha 2% trong nước cất, pH = 4); Đối chứng ( nước cất).
Tiến hành: Nhỏ 15 µL dịch cơ chất trộn với 5 mL dịch bào tửđược chuẩn bị trong nước cất được nhỏ trên bề mặt ghét nước (bản ELISA). Bản thí nghiệm được đặt trong hộp ẩm bão hòa và ủở 30 0C, trong tối. Quan sát 100 bào tử/ công thức vật liệu sau 24 giờ.
3.4.8. Phương pháp đánh giá biện pháp phòng chống bằng thuốc hóa học
3.4.8.1. Phương pháp đánh giá hiệu quả một số loại thuốc trong invitro
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Rachappa, 2007 và Amutha et al., 2010. Thí nghiệm được thực hiện bởi 3 công thức thuốc, mỗi công thức thuốc thực hiện với 3 nồng độ khác nhau và 3 lần nhắc lại.
Thí nghiệm tiến hành trong đĩa petri, pha thuốc trực tiếp vào môi trường PDA. Cấy khoanh nấm có đường kính 9 mm vào 3 vị trí khác nhau trong đĩa petri ( mỗi một vị trí trong đĩa petri tương ứng với một lần nhắc lại) đĩa petri đường kính 90 mm, sau đó đểở nhiệt độ 25 0C. Các công thức thuốc gồm:
Tên hoạt chất Tên thuốc Nồng độ khuyến cáo
Nồng độ pha ( %)
Difenoconazole Score 250EC 8ml/8 lít 0,05 % 0,1 % 0,2 % Mancozeb Dipomate 80WP 3g/16 lít 0,0095 % 0,019 % 0,038 % Carbendazim
500g/L
Carbenzim 500FL 30ml/16 lít 0,095 % 0,19 % 0,38 %
Các chỉ tiêu cần quan sát: Quan sát biến đổi của tản nấm mỗi ngày ( sợi nấm mọc ngang, mọc đứng lên, màu sắc, sự hình thành ổ nấm, …).
Hiệu lực thuốc trong phòng thí nghiệm được tính theo công thức Abbott: C - T HLT ( %) = X 100 C Trong đó: C: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng T: Đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm
Các số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học và chương trình IRRISTAT 4.03B.
3.4.8.2. Phương pháp đánh giá hiệu quả của thuốc hóa học đến nảy mầm và hình thành giác bám của nấm
Thí nghiệm đánh giá hiệu quả của thuốc hóa học đến nảy mầm bào tử và hình thành giác bám của nấm được thực hiện theo Milner et al. (1991), Rachappa (2006), Amutha et al. (2010) và Shaw et al. (2006).
Thí nghiệm được tiến hành với 7 công thức thuốc và đối chứng không sử dụng thuốc hóa học, mỗi công thức được thực hiện với 3 nồng độ khác nhau và không nhắc lại. Các công thức thuốc gồm:
Tên hoạt chất Tên thuốc
Nồng độ khuyến
cáo
Nồng độ pha ( %)
Copper oxychloride Isacop 65,2WG 40g/16 lít 0,125 % 0,25 % 0,5 % Thiophanate methyl Topan 70WP 20g/8 lít 0,125 % 0,25 % 0,5 % Trifloxystrobin250g/kg +Tebuconazole 500g/kg Nativo 750WG 30g/100 lít 0,015 % 0,03 % 0,06 % Azoxystrobin 200 g/l +Difenoconazole 125 g/l Amistar top 325SC 17ml/8 lít 0,105 % 0,21 % 0,42 %
Difenoconazole Score 250EC 8ml/8 lít 0,05 % 0,1 % 0,2 % Mancozeb Dipomate 80WP 3g/16 lít 0,0095 % 0,019 % 0,038 % Carbendazim 500g/L Carbenzim 500FL 30ml/16 lít 0,095 % 0,19 % 0,38 %
Cách tiến hành: Chuẩn bị dịch bào tử nấm và dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau, tiến hành hòa 5 µl dịch bào tử nấm + 5 µl dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau trên bảng ELISA. Sau đó giữẩm trong hộp nhựa ở nhiệt độ 30 0C.
Các chỉ tiêu cần theo dõi: Theo dõi tỷ lệ bào tử nảy mầm ( %) được đánh giá dưới kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần, quan sát 3 vi trường/ phiến kính trong 24 giờ sau khi nhỏ dung dịch thuốc và dịch bào tử. Mỗi vi trường thu thập được những thông số sau: Tổng số bào tử, số bào tử nảy mầm, số bào tử nảy mầm có hình thành đĩa áp. Cách tính tỷ lệ nảy mầm và tỷ lệ hình thành đĩa áp theo công thức sau:
X (%) = m ∑xi 0 n ∑Xk 1 x 100 Trong đó: X %: Là tỷ lệ nảy mầm ( tỷ lệ hình thành đĩa áp)
Xi: Tỷ số bào tử nảy mầm (hình thành đĩa áp)ở vi trường thứ i Xk: Là tổng số bào tử trên vi trường thứ i
3.4.8.3. Phương pháp đánh giá hiệu quả một số loại thuốc ngoài đồng ruộng
Thí nghiệm được tiến hành theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01 – 174:2014/BNNPTNT, Quy chuẩn quốc gia về khảo nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực phòng trừ bệnh loét ( Xanthomonas campestris pv.citri Hasse Dowson) hại cây có múi của các thuốc phòng trừ bệnh. Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Thiết kế khu vực thí nghiệm:
Thí nghiệm được thực hiện trực tiếp trên vườn bưởi, thí nghiệm gồm 3 loại thuốc, 3 lần nhắc lại. Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 5 cây, giữa các ô thí nghiệm có dải phân cách là 1 hàng cây. Các thuốc sử dụng gồm:
Tên hoạt chất Tên thương phẩm Nồng độ pha
Difenoconazole Score 250EC 0,1 %
Carbendazim Carbenzim 50FL 0,19 %
- Phun thuốc: Thuốc được phun, rải đều lên toàn bộ diện tích tán lá cây trong ô thí nghiệm. Thí nghiệm được tiến hành khi tỷ lệ bệnh tối thiểu 5% số quả bị nhiễm bệnh.
- Điều tra và thu thập số liệu
* Chỉ tiêu, sốđiểm và phương pháp điều tra với bệnh - Chỉ tiêu điều tra:
+ Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh
- Mỗi ô điều tra 3 cây cốđịnh, mỗi cây điều tra 4 cành/ 4 hướng, mỗi cành điều tra 5 quả.
- Thời điểm điều tra
+ Điều tra tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh: Lần điều tra thứ nhất vào 1 ngày trước khi xử lý thuốc, các lần điều tra sau vào 14, 30, 40, 55 ngày sau xử lý thuốc.
- Xử lý số liệu
Tỷ lệ bệnh được tính theo công thức sau:
Số quả bị bệnh - Tỷ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng số quả điều tra 5n5 + 4n4 + 3n3+ 2n2 + n1 + Chỉ số bệnh (%) = --- x 100