Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5.6.Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.6.Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là việc tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đưa vi khuẩn về dạng thuần khiết. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Bằng cách phương pháp phân lập vi sinh vật sẽ phân lập được vi khuẩn thuần khiết để từ đó xác định một số đặc điểm sinh vật, hóa học gây bệnh của vi khuẩn.
Môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tùy tiện hay yếm khí tùy tiện. Điều kiện sinh trưởng tối ưu là ở 37°C, tuy nhiên vẫn sinh trưởng được ở 30 - 42°C. Vi khuẩn này sinh trưởng mạnh khi bổ sung thêm 5 - 10% máu cừu vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng sinh trưởng được trên môi trường tryptose soy agar và chocolate agar. Vi khuẩn không sinh trưởng trên các môi trường MacConkey agar, Endo agar, Gassner agar, Simon citrate. Các môi trường dạng lỏng cần được lọc kỹ như môi trường BHI (brain heart infusion broth), PB (Pasteurella broth) hay Todd Hewitt broth.
Môi trường Columbia Blood Agar là môi trường được cho là phù hợp để nuôi cấy ORT, trong thí nghiệm này có bổ sung 5% máu thỏ thay cho máu cừu.
Cách pha: Cân chính xác 3,9g thạch máu Blood Agar với 100ml nước cất và hấp ướt ở 121°C trong 30 phút, để nguội 45 - 50°C sau đó bổ sung 5ml máu thỏ lắc đều cho máu thỏ hòa tan trong thạch, màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn. Sau đó đổ vào đĩa lồng (10-15 ml/ đĩa).
Hình 3.1: Thạch máu có bổ sung gentamycin Tiến hành: Tiến hành:
Mẫu sau khi lấy về được xử lý, nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia có bổ sung 5µg/ml gentamycin, ở điều kiện 37ºC, 5-10% CO2 trong vòng 48 giờ. Căn cứ vào tính chất mọc trên môi trường để chọn các khuẩn lạc riêng biệt
Khuẩn lạc ORT được nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia ở 37ºC là những khuẩn lạc nhỏ, màu xám trắng, không dung huyết ra xung quanh, trực khuẩn Gram âm, có kích thước dài ngắn khác nhau. Không mọc trên môi trường MacConkey, không có khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit, Oxydase dương tính, Catalase âm tính, Indol âm tính, Ure dương tính.
Dựa vào sơ đồ phân lập:
Hình 3.2: Sơ đồ phân lập vi khuẩn ORT Phương pháp nhuộm Gram Phương pháp nhuộm Gram
Các bước tiến hành:
Bước 1: Dàn đều tiêu bản và cố định tiêu bản. Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy 1 - 3 khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào giọt nước để khô trong điều kiện tự nhiên. Cố định tiêu bản bằng
Dịch ngoáy mắt, mũi, hầu họng của gà mắc ORT các lứa tuổi
Nuôi cấy trên môi trường thạch máu thỏ
Phân lập thuần khiết khuẩn lạc trên môi trường Columbia Blood
Agar
Nhuộm Gram, kiểm tra hình thái
Kiểm định, định loại vi khuẩn bằng các đặc tính hình thái và
sinh hóa
Giữ giống (bổ sung glycerol 25%)
cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn 2- 3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính và để vi khuẩn bắt màu được tốt hơn
Bước 2: Nhuộm màu
- Nhỏ dung dịch tím Gentians để yên trong vòng 1 phút, rửa nước. - Nhỏ dung dịch Lugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nước. - Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, rửa nước - Nhở tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nước, để khô. Quan sát ở vật kính dầu 100X.