Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5.5.Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.5.Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin theo Robert (1969) và Burn (1974). Phương pháp làm tiêu bản vi thể được thực hiện theo quy trình tẩm đúc bằng paraffin, nhuộm Hematoxilin – Eosin (HE). Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Khử formol
+ Mục đích để rửa sạch formol.
+ Sau khi cố định bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7-10 ngày, lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có kích thước 4 – 5mm, cho vào các cassette, ghi tên bệnh phẩm. Sau đó, các cassette được rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
+ Chuyển mẫu theo quy trình:
Bảng 3.1 Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình.
Bình Hóa chất Thời gian
1 Cồn 600C 1 :00 2 Cồn 600C 1 :00 3 Cồn 700C 1 :30 4 Cồn 800C 1 :30 5 Cồn 960C 1 :30 6 Cồn 1000C 1 :30 7 Cồn 1000C 1 :30 8 Cồn 1000C 1 :30 9 Xylen 1 :30 10 Xylen 1 :30 11 Parafin 2 :00 12 Parafin 2 :00
Đúc tiêu bản (đúc Block)
Mục đích: Để vùi miếng tổ chức trong môi trường Paraffin thuần nhất tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: Máy đúc block, máy làm nguội block, khuôn block, block hay khuôn giấy, paraffin, kéo, pank kẹp, …
Phương pháp tiến hành:
Đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh parafin lỏng vào block. Đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. Để nguội từ từ đến khi đông cứng đặc chắc là được.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm, phiến kính, pank kẹp, nhíp…
Cắt mảnh: Cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với độ dày 2-3µm sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
Dán mảnh: Miếng tổ chức sau khi cắt sẽ được dàn phẳng trên phiến kính nhờ cho vào bình nước ấm 500C. Sau đó để tủ ấm 370C trong 12 – 24h đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm được.
Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxilin- Eosin. Các bước nhuộm như sau:
+ Khử paraffin: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm 3 lọ: Xylen I : 30 phút
Xylen II : 30 phút Xylen III : 30 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ: Cồn I: 15 phút
Cồn II: 15 phút Cồn III : 15 phút
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 10 phút sau đó lau sạch, khô tiêu bản + Nhuộm Hematoxinlin (nhuộm nhân):
Sau khi đã rửa tiêu bản qua nước chảy trong vòng 10 phút ta đem lau khô nước xung quanh tiêu bản, đặt tiêu bản lên trên giá để rồi nhỏ Hematoxinlin ngập
tiêu bản, để trong vòng 10 phút. Sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa nước chảy trong vòng 10 phút cho hết Hematoxinlin thừa. Lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô. Kiểm tra màu sắc, tiêu bản có màu xanh tím được coi là đạt yêu cầu. Nếu nhạt màu, tiêu bản cần được nhúng qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu màu đậm quá thì dừng nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 600 + HCl, tỷ lệ là 1%) trong 30 giây.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương):
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản 5-10 phút tùy theo thực tế màu Eosin. Rửa nước chảy 10 phút cho hết Eosin thừa và lau sạch phần nước xung quanh bệnh phẩm. Tiến hành khử nước cho tiêu bản:
+ Khử nước: Ta cho tiên bản qua hệ thống 3 bình Cồn I : 1 phút
Cồn II : 1 phút Cồn III : 1 phút
+ Tẩy cồn làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua Xylen I 3-5 phút, lau sạch, khô xung quanh. Chuyển sang Xylen II để 3-5 phút, nhấc ra lau sạch cồn ở xung quanh lam kính và chuyển sang Xylen III (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Chuyển tiêu bản vào bình Xylen tủ ấm trong 2 phút.
Gắn Baume Canada
Nhỏ một giọt Baume Canada, gắn nhanh lamen lên tiêu bản khi Xylen vẫn còn ấm. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngoài.
Đánh giá kết quả
Đem soi kính hiển vi quang học với vật kính 10X. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản đặt yêu cầu khi không có nước và không xuất hiện bọt khí.