- Bệnh Cúm Gia Cầm.
Gà có tỷ lệ mắc cao và chết rất cao. Gà sốt cao, uống nhiều nước, sưng phù thủng hoại tử mào tích. Mào tím thâm, tím tái xoăn mào hoạc tụt mào. Viêm sưng phù thũng đầu và măt.
Gà thở khó, há mồm để thở có biểu hiện hen khẹc, hắt hơi và sổ mũi. Biểu hiện ở đường tiêu hóa; tiêu chảy phân xanh vàng, phân xanh, phân lẫn máu và có mùi hôi thối.
Gà đẻ có biểu hiện giảm sản lượng trướng hoặc tắt đẻ hoàn toàn.
Ngoài ra gà mắc bệnh cúm còn có những biểu hiện của triệu chứng thần kinh, ngẹo đầu, nghẹo cổ đi lại mất thăng bằng.
-Bệnh CRD
Lúc đầu lác đác có một số con chảy nước mũi, nước mắt liên tục kèm theo hay lắc đầu, vảy mỏ, gà há mồm ra thở khò khè.
kèm theo tiếng rít mạnh, gà rướn cao cổ hít khí, cuối cơn rít là tiếng đờm và bọt khí trong cổ họng.
Gà chậm lớn, kém ăn, hay vẩy mỏ, kèm theo viêm mí mắt, thối mắt, nhiều gà bị mù mắt, đầu sưng một bên hoặc hai bên hoặc sưng cả đầu.
-Bệnh Newcatstle
Ở gà nhỏ; lúc đầu gà ho hen, há mồm thở ở một số con, sau bốn ngày gà lan nhanh ra toàn đàn. Gà tụm đống lại dưới bóng sưởi hoặc tại góc chuồng.
Gà khó thở, nên nhiều con dướn cổ thật dài hoặc thật cao đẻ hít khí kèm theo tiếng rít mạnh, cuối cơn rít thở gà phát tác tiếng “tooc’ tiếng đanh và gọn. Đây là triệu chứng điển hình của Newcastle.
Gà ỉa chảy, lúc đàu loãng trắng sau đó chuyển sang xanh trắng hoặc xanh. Gà kém ăn, ủ rũ, sút gâỳ rất nhanh, chân, mỏ kém bóng láng, thậm chí khô đét, lông xù.
Một số gà bại chân, bại cánh nên loạng choạng, thất điều, mất thăng bằng khi khua đuôi. Diều gà chứa đầy hơi, dốc ngược chảy ra nước mùi chua và thối.
-Bênh IB ( viêm phế quản truyền nhiễm)
Đối với gà con trên một tháng tuổi bệnh xảy ra rất nhanh trong toàn đàn với các triệu chứng; sốt, ủ rũ, xù lông, kém ăn, thở khó, thở bằng miệng và luôn kèm theo tiếng khò khè, chảy nước mũi, nước mắt. nhiều trường hợp sau một đến hai tuần gà khỏi bệnh nhưng cũng chêt đến 40%.
Đối với gà đẻ nhiều khi không có triệu chứng lâm sàng nào ngoài giảm tỷ lệ đẻ, giảm đột ngột tới 70% và kéo dài hàng tháng. Chất lượng trứng và vỏ trứng kém.
-Bệnh ILT (Viêm thanh quản truyền nhiễm)
Bệnh chủ yếu biểu hiện ở đường hô hấp trên như; ho hen, hắt hơi, khó thở, đau mí mắt. tiến thở có nhiều đờm.
Gà có máu ở mỏ, trên tường, nền chuồng, lông xơ xác…tỷ lệ chết thấp, chết là do dịch viêm bịt kín thanh quản khiến gà chết ngạt.
Tỷ lệ đẻ giảm xuống từ 10% đến 40% kéo dài. Bảng phân biệt các triệu chứng lâm sàng.
Bệnh
Biểu hiện lâm sàng
Bên ngoài Hô hấp Tiêu hóa
Cúm gia cầm
- Triệu chứng thần kinh - Sốt cao
- Uống nước nhiều, ủ rũ, lông ướt - Mào tích sưng, sung huyết - Chân suất huyết
Thở khó, khó khè,
Tiêu chảy, phân vàng xanh, lẫn máu
CRD - Chảy nước mắt, nước mũi, xưng mắt, lông xù, gầy
- Khò khè, nhiều đờm, ngáp để thở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Phân trắng loãng
Newcastle -Gà rù, lông bết, chân khô, mào tích thâm tím.
- Gà sốt cao, ủ rũ kém ăn có biểu hiện thần kinh nghẹo đầu nghẹo cổ - Thở khó, ngáp kèm theo “tóoc” - Tiêu chảy lặng, lúc đầu phân trắng loãng sau đó chuyển sang xanh trắng. IB - Gà sốt ủ rũ xả ra nhanh toàn đàn. - Đẻ giảm 70% thở khó - Gà thở khó, sưng mắt nhẹ
- Tiêu chảy phân loãng trắng
IlT - Sốt ủ rũ, bệnh xảy ra nhanh, kém ăn - Mỏ dính máu. - Đẻ giảm - Thở khó ngáp cổ để thở - Phân loãng trắng.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Bộ môn Bệnh lý Thú Y, Khoa Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú Y, khoa Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Thời gian thực hiện: Từ 9/2015 đến 8/2016
3.3. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Gà thả vườn mắc mắc Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) tại huyện Yên Mô, tỉnh Ninh Bình
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Phân lập vi khuẩn gây bệnh
- Xác định một số đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn gây bệnh - Giám định vi khuẩn bằng PCR
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của gà mắc bệnh - Nghiên cứu tổn thương đại thể và vi thể
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp quan sát các triệu chứng lâm sàng
Chúng tôi tiến hành theo dõi, quan sát và lấy mẫu gà trên các đàn gà nghi mắc ORT nuôi tại huyện Yên Mô, tỉnh Ninh Bình; sau đó ghi chép các triệu chứng lâm sàng của gà nghi mắc ORT còn sống. Gà có các triệu chứng như: ủ rũ, gà ngáp khó thở, đôi khi hắt hơi, vảy mỏ, mũi có dịch viêm, đau mắt…
3.5.2. Phương pháp mổ khám
Với những gia cầm có triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan theo quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú Y.
- Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…).
- Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại ký sinh trùng và các tổn thương…
- Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm. - Xử lý tiêu độc xác gia cầm.
3.5.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản
Các mẫu được lấy theo quy định của ngành.
Mẫu cơ quan tổ chức cần lấy đúng (lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình), lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cấn thiết).
Mẫu có thể là dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng và dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi. Ta có thể lấy mẫu theo phương pháp sau:
- Đối với dịch ngoáy mũi và dịch ngoáy hầu họng dùng tăm bông vô trùng ngoái sâu vào lỗ mũi/ hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70° để một thời gian cho dịch mũi thấm vào tăm bông → Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart Transport Medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS, đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phòng thí nghiệm sau 2-8 giờ. Nếu ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh. Sau vận chuyển bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp.
- Đối với dịch khí quản hay dịch phế quản: dùng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo dường ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào trong môi trường như trên, đậy nút ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
- Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Với mẫu là tổ chức bệnh khác như ruột, phổi …làm tương tự.
3.5.4. Phương pháp PCR
Phương pháp chiết tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
Bước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. Ủ ở 70oC trong 30 phút. Bước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch ở dưới.
phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch dưới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 µl Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20oC.
Quy trình thực hiện phản ứng PCR Thành phẩn của phản ứng PCR: STT Nội dung Thể tích (µl) 1 Nuclease-Free Water 6,5 2 Master Mix 12,5 3 Reverse Primer 0,5 4 Forward Primer 0,5 5 DNA 5 Tổng 25
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
Giai đoạn Bước Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng
1 Duỗi mạch 94 5 phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3 Hoàn chỉnh 72 7 phút 1
Dừng phản ứng 4
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Bước 1: Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 µl Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần điện di.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT-PCR Bước 3: Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
Bước 4: Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6µl maker 100bp và 10µl sản phẩm PCR mỗi giếng.
Bước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
Bước 6: Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
3.5.5. Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin theo Robert (1969) và Burn (1974). Phương pháp làm tiêu bản vi thể được thực hiện theo quy trình tẩm đúc bằng paraffin, nhuộm Hematoxilin – Eosin (HE). Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Khử formol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Mục đích để rửa sạch formol.
+ Sau khi cố định bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7-10 ngày, lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có kích thước 4 – 5mm, cho vào các cassette, ghi tên bệnh phẩm. Sau đó, các cassette được rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
+ Chuyển mẫu theo quy trình:
Bảng 3.1 Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình.
Bình Hóa chất Thời gian
1 Cồn 600C 1 :00 2 Cồn 600C 1 :00 3 Cồn 700C 1 :30 4 Cồn 800C 1 :30 5 Cồn 960C 1 :30 6 Cồn 1000C 1 :30 7 Cồn 1000C 1 :30 8 Cồn 1000C 1 :30 9 Xylen 1 :30 10 Xylen 1 :30 11 Parafin 2 :00 12 Parafin 2 :00
Đúc tiêu bản (đúc Block)
Mục đích: Để vùi miếng tổ chức trong môi trường Paraffin thuần nhất tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: Máy đúc block, máy làm nguội block, khuôn block, block hay khuôn giấy, paraffin, kéo, pank kẹp, …
Phương pháp tiến hành:
Đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh parafin lỏng vào block. Đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block. Để nguội từ từ đến khi đông cứng đặc chắc là được.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm, phiến kính, pank kẹp, nhíp…
Cắt mảnh: Cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với độ dày 2-3µm sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
Dán mảnh: Miếng tổ chức sau khi cắt sẽ được dàn phẳng trên phiến kính nhờ cho vào bình nước ấm 500C. Sau đó để tủ ấm 370C trong 12 – 24h đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm được.
Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxilin- Eosin. Các bước nhuộm như sau:
+ Khử paraffin: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm 3 lọ: Xylen I : 30 phút
Xylen II : 30 phút Xylen III : 30 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ: Cồn I: 15 phút
Cồn II: 15 phút Cồn III : 15 phút
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 10 phút sau đó lau sạch, khô tiêu bản + Nhuộm Hematoxinlin (nhuộm nhân):
Sau khi đã rửa tiêu bản qua nước chảy trong vòng 10 phút ta đem lau khô nước xung quanh tiêu bản, đặt tiêu bản lên trên giá để rồi nhỏ Hematoxinlin ngập
tiêu bản, để trong vòng 10 phút. Sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa nước chảy trong vòng 10 phút cho hết Hematoxinlin thừa. Lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô. Kiểm tra màu sắc, tiêu bản có màu xanh tím được coi là đạt yêu cầu. Nếu nhạt màu, tiêu bản cần được nhúng qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu màu đậm quá thì dừng nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 600 + HCl, tỷ lệ là 1%) trong 30 giây.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương):
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản 5-10 phút tùy theo thực tế màu Eosin. Rửa nước chảy 10 phút cho hết Eosin thừa và lau sạch phần nước xung quanh bệnh phẩm. Tiến hành khử nước cho tiêu bản:
+ Khử nước: Ta cho tiên bản qua hệ thống 3 bình Cồn I : 1 phút
Cồn II : 1 phút Cồn III : 1 phút
+ Tẩy cồn làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua Xylen I 3-5 phút, lau sạch, khô xung quanh. Chuyển sang Xylen II để 3-5 phút, nhấc ra lau sạch cồn ở xung quanh lam kính và chuyển sang Xylen III
+ Chuyển tiêu bản vào bình Xylen tủ ấm trong 2 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gắn Baume Canada
Nhỏ một giọt Baume Canada, gắn nhanh lamen lên tiêu bản khi Xylen vẫn còn ấm. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngoài.
Đánh giá kết quả
Đem soi kính hiển vi quang học với vật kính 10X. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản đặt yêu cầu khi không có nước và không xuất hiện bọt khí.
3.5.6. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là việc tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đưa vi khuẩn về dạng thuần khiết. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Bằng cách phương pháp phân lập vi sinh vật sẽ phân lập được vi khuẩn thuần khiết để từ đó xác định một số đặc điểm sinh vật, hóa học gây bệnh của vi khuẩn.
Môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tùy tiện hay yếm khí tùy tiện. Điều kiện sinh trưởng tối ưu là ở 37°C, tuy nhiên vẫn sinh trưởng được ở 30 - 42°C. Vi khuẩn này sinh trưởng mạnh khi bổ sung thêm 5 - 10% máu cừu vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng sinh trưởng được trên môi trường tryptose soy agar và chocolate agar. Vi khuẩn không sinh trưởng trên các môi trường MacConkey agar, Endo agar, Gassner agar, Simon citrate. Các môi trường dạng lỏng cần được lọc kỹ như môi trường BHI (brain heart infusion broth), PB (Pasteurella broth) hay Todd Hewitt broth.
Môi trường Columbia Blood Agar là môi trường được cho là phù hợp để nuôi cấy ORT, trong thí nghiệm này có bổ sung 5% máu thỏ thay cho máu cừu.
Cách pha: Cân chính xác 3,9g thạch máu Blood Agar với 100ml nước cất và hấp ướt ở 121°C trong 30 phút, để nguội 45 - 50°C sau đó bổ sung 5ml máu thỏ lắc đều cho máu thỏ hòa tan trong thạch, màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn. Sau đó đổ vào đĩa lồng (10-15 ml/ đĩa).
Hình 3.1: Thạch máu có bổ sung gentamycin Tiến hành:
Mẫu sau khi lấy về được xử lý, nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia có bổ sung 5µg/ml gentamycin, ở điều kiện 37ºC, 5-10% CO2 trong