Phương pháp chiết tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
Bước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. Ủ ở 70oC trong 30 phút. Bước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch ở dưới.
phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch dưới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 µl Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20oC.
Quy trình thực hiện phản ứng PCR Thành phẩn của phản ứng PCR: STT Nội dung Thể tích (µl) 1 Nuclease-Free Water 6,5 2 Master Mix 12,5 3 Reverse Primer 0,5 4 Forward Primer 0,5 5 DNA 5 Tổng 25
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
Giai đoạn Bước Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng
1 Duỗi mạch 94 5 phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3 Hoàn chỉnh 72 7 phút 1
Dừng phản ứng 4
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Bước 1: Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 µl Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần điện di.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT-PCR Bước 3: Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
Bước 4: Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6µl maker 100bp và 10µl sản phẩm PCR mỗi giếng.
Bước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
Bước 6: Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.