Phương pháp nhuộm Gram
Các bước tiến hành:
Bước 1: Dàn đều tiêu bản và cố định tiêu bản. Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy 1 - 3 khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào giọt nước để khô trong điều kiện tự nhiên. Cố định tiêu bản bằng
Dịch ngoáy mắt, mũi, hầu họng của gà mắc ORT các lứa tuổi
Nuôi cấy trên môi trường thạch máu thỏ
Phân lập thuần khiết khuẩn lạc trên môi trường Columbia Blood
Agar
Nhuộm Gram, kiểm tra hình thái
Kiểm định, định loại vi khuẩn bằng các đặc tính hình thái và
sinh hóa
Giữ giống (bổ sung glycerol 25%)
cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn 2- 3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính và để vi khuẩn bắt màu được tốt hơn
Bước 2: Nhuộm màu
- Nhỏ dung dịch tím Gentians để yên trong vòng 1 phút, rửa nước. - Nhỏ dung dịch Lugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nước. - Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, rửa nước - Nhở tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nước, để khô. Quan sát ở vật kính dầu 100X.
3.5.7. Phương pháp thử các đặc tính sinh hóa
Phản ứng thử Oxydase: tiến hành trên giấy được tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p Phenylenediamine hydrochloride. Dùng que cấy vô trùng cấy khuẩn lạc từ môi trường thạch dàn đều trên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím đen (giấy đổi màu có thể màu xanh) sau 10 giây là phản ứng dương tính. Nếu không xuất hiện màu tím đen hay giấy không đổi màu là phản ứng âm tính.
Phản ứng Catalase: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên, trộn đều. Nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính, nếu không thấy sủi bọt là phản ứng âm tính. ORT có phản ứng Catalase âm tính
Phản ứng Indol: dùng để phát hiện vi khuẩn có enzym trytophanasa chuyển hóa trypton thành indol. Cấy vi khuẩn vào nước trypton và ủ ở 37ºC/ 24 giờ. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s, phản ứng dương tính có vòng màu đỏ cánh sen nổi lên trên (do indol kết hợp với p-dimethylaminnobelzal dehyde trong thuốc thử Kovac’s), nếu không có màu hoặc màu vàng là phản ứng âm tính.
Phản ứng phân giải Ure: phát hiện enzym ureasa phân giải urea thành amonia và cacbodioxide. Amonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường. Cấy vi khuẩn vào canh thang ure, ủ 37ºC/ 24- 48 giờ. Phản ứng dương tính: môi trường có màu tím đỏ; phản ứng âm tính: không màu.
3.5.8. Phương pháp phân tích số liệu
Các kết quả thu được trong các thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Excel
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong quá trình thực tập tại tỉnh Ninh Bình đã thu thập được 55 con gà thả vườn ở mọi lứa tuổi có những triệu chứng lâm sàng điển hình của bệnh ORT, tiến hành theo dõi, quan sát, mổ khám lấy mẫu bệnh phẩm tại các cơ quan như phổi, khí quản, gan, ruột, tim, lách, não… tiến hành các thí nghiệm để xác định bệnh nhanh chóng. Ghi lại hồ sơ mẫu với đầy đủ các thông tin từng mẫu của gà để phục vụ việc nghiên cứu và truy hồi mẫu bệnh phẩm khi cần thiết.
4.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN
Mỗi loài vi khuẩn có một đặc tính sinh học khác nhau như: tính chất mọc trên các môi trường, đặc tính sinh hóa, tính chất chuyển hóa các loại đường, khả năng sinh sản các hợp chất sinh học trung gian trong quá trình trao đổi chất vào môi trường nuôi cấy.
Để khẳng định các chủng vi khuẩn có phải là ORT hay không, chúng tôi đã giám định một số đặc tính nuôi cấy và sinh hóa trên các môi trường khác nhau. Sau khi quan sát những đàn gà có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh ORT, tiến hành mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm ria cấy trên môi trường thạch máu thỏ có Gentamycin, ủ ở tủ ấm 37ºC có bổ sung CO2 trong vòng 24 – 72 giờ quan sát thấy những khuẩn lạc có đặc điểm: khuẩn lạc nhỏ, không dung huyết ra xung quanh, màu xám tới xám trắng đôi khi có màu đỏ hung, bờ mặt lồi với bờ rìa rõ ràng. Ở những lần nuôi cấy đầu tiên khuẩn lạc có kích thước lớn nhất khoảng 1 – 3 mm sau khoảng 48 giờ nuôi cấy nhưng ở những lần sau thường khuẩn lạc nhỏ hơn và biến dạng không đồng nhất.