Nguồn: Beard (1998)
Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp các sợi dương từ khuơn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-poymerase. Các sợi này khơng được Adenine hĩa (gắn thêm các Adenine – gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hồn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các RNA thơng tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus và được enzyme PB2 gắn thêm 10 – 20 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đĩ được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nộ bào cĩ hạt để tổng hợp nên các protein của virus.
- Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngồi của màng tế bào nhiễm nhờ nộ máy Golgi, goi là hiện tượng “ nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân lên tế bào để kết hợp cới RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với cùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phịng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác (Murphy and Webster, 1996).
2.4.5. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm
Trong thực tế người ta chia virus cúm ra làm 2 loại: Loại virus độc lực thấp – LPAI và loại cĩ độc lực cao - HPAI.
- LPAI là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, cĩ thể gây bệnh cúm nhẹ khơng cĩ triệu chứng lâm sàng điển hình và khơng làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây nhiễm rộng rãi và tạo nên các chủng virus cĩ độc lực cao đồng nhiễm trêm cùng một tế bào và trở thành một lọai virus HPAL nguy hiểm.
- HPAL là loại virus cúm A cĩ khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vịng 48-72h sau nhiễm. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào xơ phơi gà, tế bào thận chĩ (MDCK) khơng cĩ trypsin. Các vị dịch lớn đều do virus HPAI gây ra, thường là virus cĩ kháng nguyên H5 và H7.
Virus cúm A cĩ tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mơ đường hơ hấp và cũng cĩ thể tác động gây tổn thương nhiều cơ quan khác trong cơ thể của động vật cảm nhiễm, do đĩ cịn được gọi là virus hướng đa phủ tạng. Khả năng gây bệnh của virus cúm A phụ thuộc vào độc lực vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus ( De Wit, 2008).
2.4.6. Triệu chứng
Biểu hiện lâm sàng của bệnh diễn biến rất đa dạng và phức tạp, nĩ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độc lực, số lượng virus, lồi nhiễm bệnh, mật độ chăn nuơi, tiểu khí hậu chuồng nuơi, chế độ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm virus …(Nguyễn Tiến Dũng, 2004).
Triệu chứng điển hình là gia cầm chết đột ngột, chết nhiều với tỷ lệ chết từ 20-100%. Con vật sốt cao, ủ rũ, bỏ ăn uống, giảm đẻ, suy yếu và đứng tụm lại thành từng đám, lơng xù, xơ xác, chảy nước mũi, dịch mũi nhày màu xám, khĩ thở, vươn cổ để thở, thở khị khè, hắt hơi, chảy nước mắt, viêm kết mạc mắt, nhắm mắt, sưng phù đầu, mào tích sưng phù, màu tím sẫm. Con vật cĩ triệu chứng thần kinh như co giật, mất thăng bằng, vận động xoay trịn.
2.4.7. Bệnh tích Bệnh tích đại thể Bệnh tích đại thể
Bệnh tích thường gặp là mào, tích sưng to, tím tái phù quanh mí mắt. Xuất huyết dưới da ống chân hoặc kẽ ngĩn chân thành vệt đỏ rất rõ. Xuất huyết điểm trên bề mặt niên mạc và tương mạc nội tạng. Xuất huyết hầu hết tồn bộ đường
tiêu hĩa, đặc biệt thấy rõ ở manh tràng và dạ dày tuyến. Túi Fabricius xung huyết và xuất huyết (Lê Văn Năm, 2004; Alexander, 2007).
Bệnh tích vi thể
Bệnh tích vi thể chủ yếu là xung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm bạch cầu đơn nhân ở não và một số cơ quan khác. Mạch quản của cơ quan như mào, tích, gan, lách, phổi, thận, cơ tìm, cơ vân, não... bị giãn rộng và thâm nhiễm tế bào (Beard, 1998).
2.4.8. Chẩn đốn bệnh
Chẩn đốn dựa vào dịch tễ học
Căn cứ vào các yếu tố dịch tễ học như bệnh lây lan nhanh, gia cầm mọi lứa tuổi, nhiều loại gia cầm mắc bệnh, tỷ lệ chết cao lên tới 100% số gia cầm mắc bệnh, những vùng cĩ ổ dịch cũ, những nơi gia cầm chưa được tiêm phịng vac xin cúm hoặc tiêm phịng chưa đủ thời gian đáp ứng miễn dịch, hoặc đã tiêm phịng nhưng qua khảo sát hiệu giá kháng thể bảo hộ chỉ đạt mức thấp.
Chẩn đốn dựa vào triệu chứng và bệnh tích
Căn cứ vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để chẩn đốn. Lưu ý các đặc điểm chính như gia cầm bệnh chảy nhiều nước mắt, viên xoang mũi, mào tích tím tái, phù đầu và mí mắt, cĩ triệu chứng thần kinh, da chân vùng khơng lơng xuất huyết.
Căn cứ những bệnh tích điển hình như phổi, gan, thận, lách sưng to. Xuất huyết mỡ vành tim, ruột viêm cata, xuất huyết. Xuất huyết dạ dày cơ, dạ dày tuyến giống bệnh Newcastle. Túi fabricius xuất huyết điểm, lỗ huyệt xuất huyết … (Alexander, 2007; Baigent and Mc Cauley, 2001).
Chẩn đốn phịng thí nghiệm
Chẩn đốn virus học: nuơi cấy, phân lập virus trên rứng gà cĩ phơi ấp 9 – 10 ngày tuổi hoặc trên mơi trường tế bào xơ phơi gà hoặc tế bào thận chĩ MDCK. Giám định virus trong dịch nuơi cấy bằng các phản ứng HA, HI.
Chẩn đốn virus bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR: cho phép xác định virus với lượng rất nhỏ. Khẳng định chắc chắn subtype H5 và N1, N6 căn cứ vào primer và probe được thiết kế đặc hiệu.
Chẩn đốn huyết thanh học: dùng phản ứng HI để phát hiện và xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gia cầm chưa tiêm phịng.
2.5. HOẠT ĐỘNG GIÁM SÁT CÚM GIA CẦM TẠI VIỆT NAM 2.5.1. Kết quả giám sát 2.5.1. Kết quả giám sát
Kể từ khi xuất hiện tại nước ta, dịch cúm gia cầm đã ảnh hưởng rất nhiều tới nước ta kể về kinh tế, chính trị, văn hĩa và xã hội. Chính vì vậy việc chủ động các biện pháp phịng bệnh luơn được Đảng và Nhà nước quan tâm. Bên cạnh đĩ, chúng ta cũng đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các tổ chức trên thế giới như FAO, VAHIP, CDC, USAID, ... qua rất nhiều chương trình giám sát chủ động nhằm phát hiện sự lưu hành của các chủng virus trong cả nước qua đĩ điều chỉnh các biện pháp phịng chống dịch cho phù hợp. Sơ lược kết quả hoạt động giám sát cúm gia cầm tại nước ta giai đoạn 2008 – 2016 như sau:
- Đối với hoạt động giám sát chủ động cúm gia cầm H5N1: Qua các dự án và ở các giai đoạn khác nhau tại nước ta đều phát hiện cĩ sự lưu hành của virus cúm gia cầm A/H5N1với tỷ lệ khá cao. Cụ thể trong tổng số 48.349 mẫu xét nghiệm đã phát hiện 1.782 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm gia cầm A/H5N1 (3,69%) trong đĩ ở dự án VAHIP trong tổng số 22.745 mẫu bệnh phẩm cĩ 680 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1 (2,99%); Ở dự án do FAO tài trợ cĩ 1.102/25.604 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (4,3%). Từ tháng 12/2015 đến tháng 2/2016 tiếp tục lẫy 3.840 mẫu bệnh phẩm tại các chợ buơn bán gia cầm sống kết quả cĩ 34/3.084 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A/H5N1 (1,10%) (Phạm Thành Long, 2016).
- Đối với giám sát lưu hành virus cúm A/H7N9 trên đàn gia cầm nhập lậu và tại các chợ buơn bán gia cầm sống: Từ tháng 6/2013 đến tháng 2/2015 đã xét nghiệm 171.250 mẫu bệnh phẩm tại các tỉnh Biên giới phía Bắc nước ta (Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh) và các điểm trung chuyển, chợ buơn bán gia cầm lớn tại Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang. Kết quả chưa phát hiện mẫu bệnh phẩm nào dương tính với virus cúm A/H7N9. Từ tháng 12/2015 đến tháng 2/2016 tiếp tục lấy 3.084 mẫu bệnh phẩm tại các chợ buơn bán gia cầm sống kết quả vẫn chưa phát hiện sự cĩ mặt của virus cúm A/H7N9 trên lãnh thổ Việt Nam (Phạm Thành Long, 2016).
- Đối với giám sát lưu hành virus cúm gia cầm A/H5N6: từ 12/2015 đến tháng 2/2016 đã triển khai chương trình giám sát lưu hành virus cúm gia cầm H5N6 tại 68 chợ buơn bán gia cầm ở 60 huyện, 32 tỉnh trong cả nước. Tổng số mẫu bệnh phẩm thu thập là 3.084 mẫu (mẫu gộp). Kết quả xét nghiệm cho
thấy cĩ 108/3.084 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N6 (3,50%) (Phạm Thành Long, 2016).
2.5.2. Kết quả phân tích virus cúm gia cầm tại Việt Nam
Để làm tốt cơng tác phịng, chống bệnh cúm gia cầm độc lực cao, ngồi việc xác định tỷ lệ lưu hành tại các địa phương trong cả nước thì cơng tác nghiên cứu, giải trình tự gen của virus để qua đĩ lựa chọn loại vac xin phù hợp cho cơng tác tiêm phịng trong cả nước. Kể từ khi dịch cúm gia cầm xuất hiện tại nước ta tới nay, virus cúm luơn luơn thay đổi về cấu trúc tạo ra các chủng virus mới cĩ độc lực cao gây nhiều khĩ khăn cho cơng tác phịng chống dịch tại các địa phương. Quá trình biến đổi của các chủng virus cúm tại Việt Nam từ 2003 đến nay được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 2.2. Tĩm tắt các chủng virus cúm gia cầm tại Việt Nam, 2003 - 2016
Năm Miền Bắc Miền Nam
2003 - 2005 Virus H5N1 xâm nhập vào Việt Nam Clade 1
2007 - 2008 Xuất hiện Clade 2.3.4 thay thế clade 1;
Clade 7 được phát hiện trên gà nhập lậu
Clade 1 phổ biến và cĩ
những biến đổi.
Clade 2.3.2/2.3.4 thỉnh
thoảng được phát hiện. 2009 Phát hiện được nhiều nhánh của clade 2.3.4
2010 Xuất hiện clade 2.3.2 giống với chủng phát hiện tại Mơng Cổ, Hong Kong.
2011 -2013 Biến đổi từ clade2.3.4 sang 2.3.2.1 với 3 nhánh phụ A, B, C
2014 Clade 2.3.2.1C là chủ yếu
Xuất hiện virus H5N6 (Clade 2.3.4.4)
Clade 2.3.2.1C phổ biến
Clade 1.1 cĩ tại một
vài ổ dịch
2015 - nay H5N6 Clade 2.3.4.4 lưu hành chủ yếu H5N1 Clade 2.3.2.1C phổ biến
Nguồn: Phạm Thành Long (2016)
2.6. CƠNG TÁC PHỊNG, CHỐNG BỆNH CÚM GIA CẦM
Tại nước ta hiện nay, bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao là 1 trong 5 bệnh ưu tiên phối hợp liên ngành giữa y tế và thú y trong việc điều tra, giám sát, chia sẻ thơng tin và nghiên cứu khoa học theo Thơng tư 16/2013/TTLT-BYT-
BNNPTNT. Đối với cơng tác xử lý các ổ dịch cúm gia cầm thực hiện theo Thơng tư 07/2016/TT-BNNPTNT ngày 31/5/2016 của Bộ Nơng nghiệp và PTNT quy định về phịng, chống dịch bệnh động vật trên cạn.
Đối với dịch cúm A/H7N9 thực hiện theo Quyết định số 210/QĐ-BNN-TY ngày 14/02/2014 của Bộ Nơng nghiệp và PTNT về việc Ban hành Kế hoạch hành động ứng phĩ khẩn cấp với các chủng virus cúm nguy hiểm cĩ khả năng lây lan sang người.
Trong điều kiện chăn nuơi gia cầm như ở Việt Nam hiện nay, để kiểm sốt dịch cúm gia cầm, một biện pháp rất quan trọng là tạo miễn dịch chủ động bằng cách tiêm vac xin cho đàn gia cầm. Theo kết quả nghiên cứu mới nhất, hiện nay tại nước ta lưu hành 2 chủng virus cúm gia cầm chủ yếu là virus cúm A/H5N1 thuộc nhánh 2.3.2.1C và virus cúm A/H5N6 thuộc nhánh 2.3.4.4 (Cục Thú y , 2016). Do đĩ các loại vac xin được sử dụng cho cơng tác tiêm phịng hiện nay là:
- Vac xin cúm gia cầm H5N1 Navet-Vifluvac sử dụng để phịng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 1, A/H5N1 nhánh 2.3.2.1C và A/H5N6 nhánh 2.3.4.4 gây ra.
- Vac xin cúm H5N1 Re-6 sử dụng để phịng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 2.3.2.1C gây ra.
- Vac xin H5N1 Re-5 cĩ thể phịng bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 nhánh 1 và virus cúm A/H5N6 nhánh 2.3.4.4 gây ra.
Bên cạnh đĩ cần tăng cường hoạt động giám sát chủ động đặc biệt là tại các tỉnh vùng biên giới, các chợ buơn bán, các điểm thu gom gia cầm sống để phát hiện thêm các chủng virus mới cũng như xác định sự lưu hành của virus tại các địa phương qua đĩ đưa ra các cảnh báo sớm, các khuyến cáo kịp thời trong cơng tác phịng chống dịch.
2.7. NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT REALTIME PCR
Kỹ thuật Real time PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Trong kỹ thuật PCR truyền thống, sản phẩm khuyếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gel agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, Realtime – PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Cúm gia cầm cĩ vật chất di truyền là RNA nên trong kỹ thuật real time PCR cĩ thêm quá
trình sao chép ngược từ RNA → DNA gọi là Reverse transcription nên phương pháp này được gọi là Real time RT – PCR.
Nguyên lí hoạt động của Probe: Cĩ nhiều loại hĩa chất phát huỳnh quang dựa trên Primer và Probe, hĩa chất được sử dụng cho kỹ thuật Real time RT – PCR phát hiện virus Cúm gia cầm tại Cơ quan Thú y vùng II là Taqman Probe.
Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dị Taqman probe, cùng với các primer.
Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ (reporter) và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’ (quencher). Khi cịn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nĩ nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đơi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.