4. Bố cục của luận văn
2.4.4.4.Kỹ thuật xác định biến thể thiếu enzyme G6PD
Mẫu máu được xác định thiếu hụt enzyme G6PD qua điều tra sẽ được phân tích. Phương pháp phân tích tỷ lệ thiếu enzyme G6PD và các biến thể enzyme G6PD theo quy trình Goo Youn-Kyoung và cộng sự (2014).
Tách chiết DNA bằng kit genomic DNA Prep kit theo hướng dẫn nhà sản xuất đưa ra.
Phân tích biến thể G6PD bằng bộ sinh phẩm DiaPlexC G6PD genotyping kit (Asian type; SolGent, Hàn Quốc). Bộ sinh phẩm này có thể phân biệt được 7 biến thể thường gặp ở các nước trong khu vực Tây Thái
Bình Dương trên gen G6PD bằng kỹ thuật sinh học phân tử PCR-RFLP.
Bộ sinh phẩm có thể phân biệt được 7 biến thể gen G6PD bằng phản ứng sinh học phân tử. Bộ sinh phẩm xác định biến thể gồm:
+ 2 ống hỗn hợp PCR và 1 ống hỗn hợp mồi;
+ 1 ống thang chuẩn DNA và 1 ống chứng dương đột biến; + 1 ống chứng dạng dại.
- Thành phần cho một phản ứng PCR như sau:
+ PCR master mix 12,5
+ Mồi hỗn hợp 2
+ Nước khử ion 8,5
+ DNA khuôn 2
- Chu kỳ phản ứng PCR như sau:
+ Chu kỳ phản ứng 95°C trong 15 phút; + 30 chu kỳ bao gồm 95°C trong 30 giây; + 60°C trong 30 giây;
+ 72°C trong 40 giây;
+ Cuối cùng là 72°C trong 10 phút.
- Điện di trên gel 2% trong 30 phút cường độ 100 V, nhuộm gel bằng
dung dịch redsafe. Kiểm tra kết quả dưới đèn tử ngoại;
- Kết quả phân tích cụ thể như sau:
+ Biến thể Vanua Lava: có kích thước 154 bp; + Biến thể Mahidol có kích thước: 337 bp; + Biến thể Coimbra có kích thước 234 bp; + Biến thể Viangchan có kích thước 501 bp; + Biến thể Union có kích thước 803 bp; + Biến thể Canton có kích thước 681 bp; + Biến thể Kalping có kích thước 557 bp.
Trường hợp những mẫu phát hiện có nhiều băng thì có thể tiến hành giải trình tự toàn bộ gen G6PD (kích thước khoảng 5,8Kb), đối chiếu với ngân hàng gel để xác định các biến thể khác. Phương pháp PCR-RFLP để phân tích kiểu gen đột biến để xác định các biến thể enzyme G6PD:
Viangchan: Cặp mồi đột biến được thiết kế bởi Nuchprayoon và cộng sự (2002)
871F: 5’-TGGCTTTCTCTCAGGTCTAG-3’
G6PD10R: 5’-GTCGTCCAGGTACCCTTTGGGG-3’ Kích thước sản phẩm: 126 bp.
Mahidol: Cặp mồi đột biến được thiết kế bởi Huang và cộng sự (1996)
487F: 5’-GCGTCTGAATGATGCAGCTCTGAT-3’
487R: 5’-CTCCACGATGATGCGGTTCAAGC-3’
Kích thước sản phẩm: 104 bp
Union: Cặp mồi đột biến được thiết kế bởi Huang và cộng sự (1996)
1360F: 5’-ACGTGAAGCTCCCTGACGC-3’
1360R: 5’-GTGAAAATACGCCAGGCCTTA-3’
Kích thước sản phẩm: 214 bp
Canton: Cặp mồi đột biến được thiết kế bởi Huang và cộng sự (1996)
1376F: 5’-ACGTGAAGCTCCCTGACGC-3’ 1360R: 5’-GTGAAAATACGCCAGGCCTTA-3’ Kích thước sản phẩm: 214 bp Kaiping: 1388F: 5’-ACGTGAAGCTCCCTGACGC-3’ 1388R: 5’-GTGCAGCAGTGGGGTGAACATA-3’ Kích thước sản phẩm: 227 bp
Chu trình PCR được thực hiện như dưới đây: 95°C 5 phút
95°C 45 giây
56°C 45 giây Lặp lại 40 chu kỳ.
72°C 45 giây 72°C 7 phút
Thử nghiệm RFLP: Thực hiện theo bảng dưới đây:
Bảng 2.2. Biến thể và các enzyme phân cắt giới hạn áp dụng phân tích
Biến thể Enzym phân cắt giới hạn Ngưỡng bình thường (bp) Ngưỡng đột biến (bp) Viangchan Xba I 126 106+20 Mahidol Hind II 104 82+22 Union Hha I 142+45+27 187+27 Canton Afl II 214 194+20 Kaiping Nde I 227 206+21
Điện di và phân tích trên gel agarose 3%.