- Bổ sung 1 lít EtOAc Lớp nước –
c. Phương pháp xác định khả năng bắt giữ kim loạ
Khả năng bắt giữ kim loại của các hợp chất được xác định bằng phương pháp liên kết cạnh tranh (Agirova, Ortherth, 2003). Mỗi 100 µl ở các nồng độ khác nhau của các hợp chất pha trong nước được phối trộn với 100 µl CuSO4 0.1 µM. Sau đó, mỗi 100 µl hỗn hợp được bổ sung vào 100 µl calcein 0,1 µM, huỳnh quang của dung dịch hỗn hợp được đo bằng thiết bị đọc phiến 96 giếng Tecan GENis với bộ lọc huỳnh quang sử dụng các bước sóng kích thích và phát quang tương ứng là 485 và 535 nm và so sánh với cường độ huỳnh quang của mẫu đối chứng chỉ chứa calcein.
Các bước tiến hành:
+ Cho vào mỗi giếng 100 µL dung dịch calcein 100 µM.
+ Bổ sung 100 µL hỗn hợp (200 µL mẫu thử + 200µL CuSO4 0,4 uM) + Đo huỳnh quang bằng thiết bị Tecan GENis với bộ lọc huỳnh quang sử dụng các bước sóng kích thích và phát quang tương ứng là 485 và 535 nm.
2.2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
Hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân 4-nitrophenyl-a-D-glucopyranoside thành đường glucose và p-nitrophenol, hợp chất có màu vàng, dưới xúc tác của enzyme α-glucosidase. Khi mẫu thử có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase, sự tạo thành hợp chất p-nitrophenol sẽ giảm, do vậy mật độ quang (OD) của p-nitrophenol so với mẫu chứng chế sẽ giảm theo. OD của p- nitrophenol sinh ra sau phản ứng được đo ở bước sóng 405nm và được dùng để đánh giá hoạt động ức chế enzyme của mẫu thử. Hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase được tiến hành theo phương pháp của Li và cộng sự (Li et al., 2009). Tất cả các hóa chất sử dụng được mua của hãng Sigma (St. Louis, MO, USA).
Tóm tắt các bước tiến hành:
+ Một hỗn hợp của 50 µl các chất và 50 µl đệm phosphate 0,1 M (pH 7,0) có chứa dung dịch enzym α-glucosidase (0,3 U/mL) và 50 μl nước cất được ủ trong các phiến 96 giếng ở nhiệt độ 37 °C trong 15 phút.
+ Sau quá trình ủ khởi đầu, 100 μL của dung dịch p-NPG 3 mM trong đệm phosphate 0.1 M (pH 7.0) được bổ sung vào mỗi giếng tại các các khoảng thời gian giãn cách định sẵn.
+ Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37 °C trong 10 phút và dừng phản ứng bằng các bổ sung 750 μL Na2CO3 0,1 M.
+ Cường độ hấp phụ được đo ở bước sóng 405 nm bằng thiết bị FLUOstar Optima (BMG Labtech, Offenburg, Germany).
Kết quả được biểu thị là % ứng chế enzym α-glucosidase và được tính toán theo công thức sau:
% ức chế = x100 A A A control extract control -
Phân tích thống kê. Tất cả các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình. Số liệu được biểu thị dưới dạng: giá trị trung bình ± SD. Các kết quả được phân tích thống kê bằng chương trình ANOVA và Duncan’s multiple range. Sai số p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.