3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.4.2. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) và pha kháng thể 4log2 (hay 16 HI)
16 HI)
* Nguyên lý phản ứng:
Phàn ứng HI được thực hiện nhằm phát hiện kháng thể dại chó trong mẫu huyết thanh kiểm tra.
**Tiến hành phản ứng HI:
Phản ứng tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn 96 lỗ đáy chữ U. Để xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu virus dại trong huyết thanh chó mỗi dãy 12 lỗ sử dụng cho một phản ứng.
Bước 1: Cho vào tất cả các lỗ 25 µL dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) Bước 2: Cho vào lỗ thứ nhất 25 µL huyết thanh cần kiếm. Trộn đều bằng cách hút nhả hút nhả, rồi hút qua lỗ thứ 2 và tiếp tục các thao tác cho đến lỗ 10 thì hút bỏ 25 µL. Chừa lỗ thứ 11 và 12 không có huyết thanh làm đối chứng âm tính kháng thể.
Bước 3: cho vào tất cả các lỗ từ số 1 đến 11 mỗi lỗ nhỏ 25 µL dung dịch có chứa virus 4HA, chừa lỗ thứ 12 làm đối chứng không virus lẫn không kháng thể. Để yên 10 phút.
Bước 4: Cho vào tất cả các lỗ mỗi lỗ 25 µL huyền dịch hồng cầu 4 HA đã được kiểm tra ở mục trên. Để yên và chờ đọc kết quả sau khoảng 15 - 60 phút phụ thuộc kết quả lỗ thứ 12 (chỉ bao gồm hồng cầu và dung dịch sinh lý), khi đó hồng cầu ở lỗ 12 đã chìm xuống tạo thành chấm đỏ ở tâm lỗ khay. Phản ứng ngăn trở ngưng kết cho hình ảnh đọc được bằng mắt thường: các hồng cầu chìm xuống và tạo thành chấm đỏ đậm ở đáy của lỗ, tương tự như ở lỗ thứ 12 và đối lập với lỗ thứ 11 có hồng cầu không chìm xuống tâm đáy lỗ. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh còn cho phản ứng dương tính.
Các mẫu huyết thanh dương tính được pha loãng để có nồng độ kháng thể 4 log2 (tức 16 HI). Với các mẫu 4 log2 (có hiệu giá HI biểu hiện ở lỗ thứ nhất đế lỗ thứ 4) thì để nguyên, các mẫu 5, 6, 7... log2 được pha loãng 2, 4, 8... lần (tỷ lệ huyết thanh/dung dịch nước muối sinh lý tương tự là 1:1, 1:3, 1:7...). Bảo quản các mẫu huyết thanh 4 log2 trong từng ống nhỏ mỗi ống 1 mL ở nhiệt độ khoảng -20 oC chuẩn bị cho phản
ứng SSDHI phát hiện virus dại. Mỗi lần thực hiện xét nghiệm SSDHI cần giải đông một số ống huyết thanh vừa đủ cho số mẫu cần kiểm.
Bảng 2.2. Sơ đồ phản ứng ngăn trởngưng kết hồng cầu (HI)
Nguyên liệu Lỗ số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Pha loãng huyết thanh Dung dịch nước muối sinh lý (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Kháng huyêt thanh cần kiểm (µl) 25 Trộn và chuyển 25 µL từ lỗ thứ nhất sang lỗ kế tiếp bên phải. Hút bỏ 25 µL khỏi lỗ 10 sau khi
trộn xong. Lỗ 11 và lỗ 12 là hai lỗ đối chứng dương và đối chứng âm
- -
Cho KN Dịch virus
4HA 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Cho HC HC 1%
(µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
2.4.3. Phản ứng trắc định xê lệch ngăn trởngưng kết hồng cầu (SSDHI)
* Nguyên lý phản ứng:
Dịch lọc bệnh phẩm tiếp xúc trước với kháng huyết thanh, nếu chứa kháng nguyên virus dại thì sẽ làm giảm kháng thể đặc hiệu trong kháng huyết thanh, phản ứng sẽ biểu hiện lệch trái so với dãy chuẩn.
** Tiến hành phản ứng SSDHI:
Phản ứng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn 96 lỗ đáy chữ U. Ta đặt khay nằm dọc, được 12 dãy lỗ, mỗi dãy có 8 lỗ. Trên mỗi khay có 11 mẫu cần kiểm được thực hiện kèm theo một mẫu chuẩn làm đối chứng. Ghi số thứ tự các lỗ từ 1 đến 8 trên đầu khay.
Các dãy mẫu kiểm tra ta tiến hành các bước như sau:
Bước 1: Dùng pipet cho vào lỗ số 2 đến số 8 của mỗi dãy, mỗi lỗ cho 25 µL dung dịch nước muối sinh lý NaCl (pH7,2), (để trống 1 lỗ thứ nhất).
Bước 2:Cho vào lỗ số 1 của các dãy 25 µL dịch chiết mẫu bệnh phẩm (dịch nước bọt chó), mỗi lỗ đầu dãy chứa một mẫu (ghi số mẫu ở đầu mỗi dãy).
Bước 3: Hút 25 µL kháng huyết thanh chuẩn 4log2 cho vào mỗi lỗ thứ nhất của mỗi dãy, dùng pipet trộn và hút 25 µL chuyển từ lỗ thứ nhất sang lỗ thứ 2 rồi sang lỗ thứ 3 và lần lượt đến lỗ thứ 8 thì hút bỏ 25 µL.
Bước 4:Cho vào 25 µL dung dịch virus 4HA từ lỗ thứ nhất đến lỗ thứ 7. Bước 5: Cho vào tất cả các lỗ 25 µL huyết dịch hồng cầu 1%.
Đối chứng âm (phản ứng chuẩn) được thực hiện ở dãy cuối cùng của mỗi khay, gồm các bước sau:
Cho vào tất cả các lỗ khay của dãy làm đối chứng 25 µL nước muối sinh lý. Nhỏ vào lỗ thứ nhất 25 µL huyết thanh chuẩn, hút trộn và chuyển 25 µL sang lỗ thứ 2 và tiếp tục trộn chuyển như vậy cho đến hết dãy thì hút bỏ 25µL.
Nhỏ dung dịch virus 4HA từ lỗ thứ nhất đến lỗ thứ 7. Nhỏ vào tất cả các lỗ 25 µL huyết dịch 1% hồng cầu.
Đậy nắp khay để ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút đến 4 giờ, kiểm tra kết quả khi phản ứng ngưng kết hồng cầu của dãy đối chứng âm biểu hiện rõ.
Bảng 2.3. Sơ đồ tiến hành phản ứng trắc định xê lệch ngăn trởngưng kết hồng cầu (SSDHI):
3A. Thành phần của một trong số 11dãy kiểm trên một khay vi chuẩn độ 12 dãy × 8 lỗ
Nguyên liệu
Lỗ số
1 2 3 4 5 6 7 8
Dung dịch nước muối
sinh lý (µL) - 25 25 25 25 25 25 25
Dịch nước bọt (µL) 25 -
Kháng huyết thanh
chuẩn 4log2 (µL) 25
Trộn và chuyển 25µL từ một lỗ sang lỗ kế tiếp bên phải. Cứ thế đến lỗ số 7 thì hút bỏ
25µL sau khi trộn xong
-
Dịch virus 4HA 25 25 25 25 25 25 25 -
3B. Thành phần của một dãy đối chứng (duy nhất) trên một khay vi chuẩn độ
12 dãy × 8 lỗ nêu trên
Nguyên liệu
Lỗ số
1 2 3 4 5 6 7 8
Dung dịch nước muối
sinh lý (µL) 25 25 25 25 25 25 25 25
Dịch nước bọt (µL) - -
Kháng huyết thanh
chuẩn 4log2 (µL) 25
Trộn và chuyển 25µL từmột lỗ sang lỗ kế tiếp bên phải. Cứ thế đến lỗ số 7 thì hút bỏ 25µL
sau khi trộn xong
-
Dịch virus 4HA 25 25 25 25 25 25 25 -
HC ngan 1% (µL) 25 25 25 25 25 25 25 25
***.Đọc kết quả:
Đọc kết quả khi dãy chuẩn thể hiện: 4 lỗ đầu và lỗ thứ 8 không có ngưng kết hồng cầu chìm xuống tâm lỗ khay. Có thể gặp trường hợp 3 lỗ đầu hay 5 lỗ đầu của dãy chuẩn không ngưng kết (do nồng độ kháng nguyên gắn hồng cầu thay đổi ngẫu nhiên). Khi đo đường chuẩn sẽ là sau 3 hoặc 5 lỗ khay đầu tương ứng.
Phản ứng âm tính: không có sự xê lệch lỗ ngưng kết đầu so với dãy đối chứng (lổ số 4 là lỗ đầu không ngưng kết).
Phản ứng dương tính: có sự xê lệch lỗ ngưng kết đầu sang trái (ngưng kết cuối cùng ở các lỗ 3, 2, hoặc 1) so với dãy đối chứng.