3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.5.5. Chẩn đoán huyết thanh học
1.5.5.1. Phản ứng ngăn trởngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) trắc định kháng thể
Được thực hiện như phương pháp đã mô tả trước đây (Boyden, 1951) với hồng cầu gắn kháng nguyên cải tiến. Kháng nguyên hồng cầu gắn virus được chế trước qua các bước lasota hóa, formalin hóa, tannin hóa và với virus hóa, pha thành huyễn dịch 1% (khối lượng ướt/thể tích, pha đúng nhờ so màu một huyễn dịch hồng cầu chuẩn) ta có kháng nguyên IHA. Phản ứng IHA được thực hiện trên mỗi dãy 12 lỗ khay để trắc định kháng thể trong huyết thanh. Sau khi xác định nồng độ kháng thể, các kháng huyết thanh được pha với dung dịch sinh lí để có nồng độ kháng thể có hiệu giá IHA 4log2 (kháng huyết thanh 16 IHA) để làm nguyên liệu cho phản ứng SSIA (Nguyễn Thị Hoàng Oanh và cs, 2012).
1.5.5.2. Phản ứng trắc định xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn (SSIA)
SSIA là phương pháp được thiết lập cách đây không lâu và xuất phát từ nguyên tắc của phương pháp IHA, đã sử dụng trong phát hiện kháng nguyên một số virus trong đó có virus dại (Phạm Hồng Sơn và cs, 2014). Nếu có sẵn kháng thể chuẩn kháng dại, ta thiết lập phản ứng ngưng kết ổn định với kháng nguyên IHA, khi đó, nếu cho kháng thể đó tiếp xúc trước với bệnh phẩm chứa virus dại rồi cho hỗn hợp tiếp xúc với kháng nguyên IHA thì hiệu giá ngưng kết của kháng thể chuẩn sẽ giảm do một lượng kháng thể đã tham gia phản ứng với kháng nguyên bệnh phẩm và trở nên không tự do để tham gia phản ứng với kháng nguyên IHA (Phạm Hồng Sơn, 2009). Ngược lại, nếu trong bệnh phẩm có kháng thể với lượng đủ lớn thì kháng thể này sẽ cộng hợp với kháng thể chuẩn và làm tăng hiệu giá kháng thể khi tham gia phản ứng với kháng nguyên IHA. Do virus dại bài xuất theo nước bọt, nên nước bọt của chó là bệnh phẩm thích hợp, nếu cho nước bọt tiếp xúc trước với kháng thể chuẩn trước khi tiếp xúc với hồng cầu kháng nguyên, hoặc được tăng cường nếu trong dịch bệnh phẩm có chứa kháng thể, hay có sự xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn (Phạm Hồng Sơn, 2009).
1.5.5.3. Phương pháp ELISA
Phản ứng ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một trong những phương pháp sử dụng kháng thể đánh dấu. Phương pháp này có các biến thể khác nhau: ELISA trực tiếp và ELISA gián tiếp (Đinh Thị Bích Lân, 2007). Phương pháp ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể đánh dấu enzyme (conjugate) trực tiếp chống lại kháng nguyên trong thành phần kháng nguyên của mầm bệnh. ELISA gián tiếp kháng thể phát hiện kháng nguyên virus không cần đánh dấu và kháng thể thứ hai kháng kháng thể được sử dụng như là kháng thể chỉ báo, phân biệt phản ứng dương tính và âm tính nhờ sự biến đổi hay không biến đổi của chất màu (Phạm Hồng Sơn và Bùi Quang Anh, 2006). Ưu điểm của phương pháp ELISA gián tiếp là có độ nhạy cao, giảm thiểu sự chuẩn bị kháng thể kháng virus không cần đánh dấu và kháng kháng thể được sử dụng như là kháng thể chỉ báo, nhưng chỉ sử dụng được đối với huyết thanh của loài động vật hay đối tượng nhất định (Đinh Thị Bích Lân, 2007).
1.5.5.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang
Nguyên lý: đánh dấu kháng thể bằng chất nhuộm màu là fluorochrome, làm cho kháng thể phản ứng với kháng nguyên đặc hiệu (nếu hiện diện) và sau đó quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (Đinh Thị Bích Lân, 2007). Trường hợp bệnh dại, khi kháng nguyên kết hợp với kháng thể được đánh dấu bằng isothiocynate fluorescin (chất nhuộm màu sử dụng nhiều nhất) sẽ xuất hiện những tiểu phần phát sáng màu xanh hoặc vàng xanh lá cây nhạt trên một nền đen. Hiện nay, phương pháp miễn dịch huỳnh quang cho kết quả chẩn đoán xét nghiệm nhanh nhất và chính xác nhất (98 -
99,4%) so với các phương pháp khác. Đồng thời có thể được sử dụng ở các phòng xét nghiệm chuyên về bệnh dại (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2008).
+ Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp tiến hành được khi có sẵn kháng thể kháng virus dại đã được đánh dấu chất huỳnh quang (conjugate huỳnh quang trực tiếp: direct fluorescence-conjugated antibody). Chất huỳnh quang có thể dùng là fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethyl rhodamin-isothiocyanate (TRTC), lissamin - rhodamin B (rhodamin B 200), acid diaminonaphtylamin sulfonic (DANS),... Trước tiên ta làm tiêu bản vết in, lát cắt hoặc làn mỏng trên phiến kính từ bệnh phẩm là não, nước bọt,... của vật nghi dại, để khô trong không khí rồi cố định bằng cách ngâm vào acetone lạnh −10 - −20°C (cố định bằng cách này giữ được tính kháng nguyên của bệnh phẩm). Phủ tiêu bản bằng 1 - 2 giọt conjugate huỳnh quang trực tiếp, để ở nhiệt độ phòng 30 phút đến 1 giờ, rồi đem rửa nước, để khô và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (chú ý: trong phòng tối). Phản ứng dương tính khi tiêu bản phát sáng, do conjugate không bị nước rửa trôi (nhờ liên kết đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể) nên chất huỳnh quang trên đó phát bức xạ dưới sự kích thích của bức xạ quang học thích hợp (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2008).
+ Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp thực hiện được khi có conjugate huỳnh quang gián tiếp, tức chất được nhuộm huỳnh quang là kháng thể kháng epitope của kháng thể loài động vật cần nghiên cứu (Đinh Thị Bích Lân, 2007), ví dụ, thỏ được tối miễn dịch bằng IgG của chó rồi lấy máu thỏ chiết kháng thể chống IgG chó rồi đem đánh dấu bằng chất huỳnh quang FITC ta có conjugate huỳnh quang gián tiếp thỏ kháng chó: Rab/antiDog(IgG/FITC). Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp đa năng hơn phản ứng huỳnh quang trực tiếp. Khi có kháng nguyên chuẩn ta có thể phát hiện được kháng thể và ngược lại. Độ nhạy của phản ứng cũng cao hơn nhiều. Sau khi cố định tiêu bản kháng nguyên (chuẩn hoặc bị kiểm) ta phủ tiêu bản bằng 1 giọt kháng thể (bị kiểm hoặc chuẩn), ủ ẩm ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút đến 1 giờ ta rửa bằng nước rồi phủ bằng conjugate huỳnh quang gián tiếp kháng loài thích hợp. Sau một thời gian ủ ẩm lại đem rửa nước, làm khô rồi hiển vi. Kết quả phản ứng tương tự như trên (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2008).