PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

5. Những điểm mới của đề tài

2.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1. Phương pháp điều tra

2.4.1.1. Điều tra thực trạng cơ sở giết mổ

Sử dụng các chỉ tiêu trong biên bản kiểm tra điều kiện vệ sinh thú y, an toàn thực phẩm đối với CSGM gia súc, tại phụ lục số BB 2.16 của Thông tư 45/2014/TT-BNNPTNT.

Lập thành biên bản, để điều tra thu thập số liệu hiện trạng hoạt động CSGM, 01 biên bản điều tra/01 CSGM; các câu hỏi được trực tiếp hỏi chủ cơ sở, hỏi công nhân làm việc trong cơ sở và hỏi những người có liên quan đến nội dung nghiên cứu của đề tài.

Thời gian điều tra: Sáng từ 03 giờ đến 06 giờ, chiều từ 15 đến 18 giờ.

2.4.1.2. Cách thức đánh giá xếp loại cơ sở giết mổ

+ Lỗi nhẹ (Mi): là sai lệch so với quy chuẩn kỹ thuật, có thể ảnh hưởng đến ATTP phẩm hoặc gây trở ngại cho việc kiểm soát ATTP nhưng chưa đến mức nặng.

+ Lỗi nặng (Ma): Là sai lệch so với tiêu chuẩn, có thể ảnh hưởng đến ATTP, nếu kéo dài sẽ gây mất ATTP, tác động xấu đến môi trường.

+ Lỗi nghiêm trọng (Se): Là sai lệch so với tiêu chuẩn, gây mất an toàn thực phẩm (ATTP), tác động xấu đến môi trường, ảnh hưởng tới sức khoẻ người tiêu dùng.

Bảng 2.2. Xếp loại cơ sở giết mổ

Xếp loại Mức lỗi Nhẹ (Mi) Nặng (Ma) Nghiêm trọng (Se) Loại A ≤ 15 0 0 Loại B Từ 15 đến 30 0 0 Ma ≤ 15 và tổng Mi + Ma ≤ 30 0 Loại C Ma ≤ 15 và tổng Mi + Ma > 30 0 - > 15 0 - -  1 Ghi chú: (-) Không tính đến

2.4.1.3. Diễn giải cách thức xếp loại cơ sở giết mổ

- Cơ sở đủ điều kiện: khi cơ sở xếp loại A hoặc B.

+ Cơ sở được xếp loại A khi đạt các điều kiện sau: không có lỗi nặng và lỗi nghiêm trọng;và tổng số sai lỗi nhẹ (Mi) không quá 15 chỉ tiêu.

+ Cơ sở xếp loại B khi thỏa mãn các điều kiện sau: không có lỗi nghiêm trọng và một trong hai trường hợp sau: không có lỗi nặng, tổng số lỗi nhẹ từ 15-30 chỉ tiêu; hoặc số lỗi nặng không quá 15 chỉ tiêu và tổng số lỗi nhẹ + nặng không quá 30 chỉ tiêu.

- Cơ sở xếp chưa đủ điều kiện: khi cơ sở xếp loại C.

Cơ sở xếp loại C khi vướng vào một trong các điều kiện sau: có lỗi nghiêm trọng hoặc một trong các trường hợp sau: có số lỗi nặng lớn hơn 15 chỉ tiêu; hoặc có dưới hoặc bằng 15 lỗi nặng và tổng số lỗi nhẹ và nặng lớn hơn 30 chỉ tiêu.

2.4.2. Phương pháp lấy mẫu kiểm tra đánh giá ô nhiễm vi khuẩn

Mẫu được lấy ngẫu nhiên tại CSGM lợn và CSKD thịt lợn tại địa điểm nghiên cứu.

Lấy mẫu và bảo quản mẫu theo QCVN 01 – 04:2009

2.4.2.1. Số lượng mẫu

Số lượng mẫu là 120 mẫu; trong đó số mẫu lấy tại CSGM = 60 mẫu/02 CSGM và CSKD sản phẩm thịt lợn = 60 mẫu/02 CSKD.

Thời gian lấy mẫu: tại CSGM vào lúc 04-05 giờ sáng, tại CSKD lúc 08-10 giờ sáng.

2.4.2.2. Cách lấy mẫu

a. Vật liệu, dụng cụ lấy mẫu

- Dụng cụ cắt mẫu được vô trùng (dao); - Túi đựng mẫu bằng chất dẻo vô trùng; - Găng tay vô trùng;

- Thùng xốp bảo quản mẫu, với túi đá lạnh hoặc đá khô;

- Các nhãn ghi ký hiệu: ký hiệu mẫu, thời gian lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, cơ sở được chọn lấy mẫu;

- Dây buộc từng túi đựng mẫu (dây cao su).

b. Cách tiến hành lấy mẫu tại CSGM

Lấy mẫu thịt mảnh: chọn ngẫu nhiên trên thân thịt, sử dụng dụng cụ cắt chuyên dụng để lấy từ 03g đến 05g thịt trên các mặt cắt khác nhau. Gộp các miếng mô vừa cắt

thành một mẫu, cho vào túi đựng mẫu vô trùng, dùng dây cao su buộc miệng túi, sau đó cho vào thùng xốp chứa đá khô để bảo quản.

Hình 2.1. Lấy mẫu ở cơ sở giết mổ

c. Cách tiến hành lấy mẫu tại CSKD

Lấy mẫu thịt đã pha lọc: chọn ngẫu nhiên mẫu thịt pha lọc ở CSKD, lấy mẫu bằng cách cắt tại các mặt cắt khác nhau của miếng thịt, mỗi vị trí cắt khảng 03g đến 05g. Gộp các miếng mô vừa cắt thành một mẫu, cho vào túi đựng mẫu vô trùng, dùng dây cao su buộc miệng túi, sau đó cho vào thùng xốp chứa đá khô để bảo quản.

2.4.2.3. Phương pháp bảo quản và vận chuyển mẫu

- Bảo quản: mẫu được bảo quản ở 0oC– 2oC trong thùng xốp có đá khô. Chú ý tránh để các mẫu đông lạnh hoặc tiếp xúc trực tiếp với các khối đá đông lạnh. Mẫu được bảo quản ở 0o

C – 2oC tối đa 24h.

- Vận chuyển: mẫu được vận chuyển bằng phương tiện chuyên dụng đến phòng thí nghiệm và mẫu được xử lý trong vòng 6h sau khi lấy mẫu.

2.4.3. Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu vi sinh vật

2.4.3.1. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên thịt

* Nguyên tắc

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn sinh trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật đổ đĩa trên cơ sở số lượng mẫu đã xác định và xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu.

Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng khác nhau, sau khi nuôi cấy ở 370C trong 24 - 48 giờ.

Số khuẩn lạc được tính trong 1g hay 1ml mẫu.

* Các bước tiến hành

Bước 1: lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: đồng nhất mẫu và pha loãng

Đồng nhất mẫu:

Cân 1g thịt cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào 9ml dung dịch đệm pepton, tiến hành nghiền nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1

. Pha loãng mẫu:

Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette với đầu tuýp vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2, tương tự ta lấy 0,1ml dịch mẫu 10-2

cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm pepton đã chuẩn bị sẵn ta có độ pha loãng 10-3

. Cứ tiếp tục như vậy ta sẽ có các nồng độ 10-4

Lưu ý khi pha loãng mẫu:

Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của bệnh phẩm, thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản, kinh nghiệm người tiến hành thí nghiệm.

Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn. Các ống nghiệm phải tuyệt đối vô trùng. Sử dụng 1 micropipet 1ml/1 nồng độ pha loãng mẫu tránh hiện tượng sai số.

Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều.

Tất cả thao tác phải tiến hành trong điều kiện vô trùng. Bước 3: Cấy mẫu

Đổ môi trường thạch dinh dưỡng PCA đã hấp vô trùng, để nguội 450C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi để các đĩa đông tự nhiên. Dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri trải cấy bằng phương pháp lắc bi. Lắc nhẹ nhiều lần để mẫu phân tán đều vào môi trường, lật ngược đĩa và ủ ở 36 - 380C trong 24 - 48 giờ. Mỗi nồng độ cấy vào 2 đĩa peptri.

Bước 4: Đọc kết quả

Sau 24 giờ nuôi cấy thì ta tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy. Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó (Francis and O’Beirne, 2002).

Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 30 – 300 để tính kết quả.

Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g sản phẩm được tính theo công thức sau:

X= C

(n1 + 0,1n2) dV Trong đó:

C - tổng số khuẩn lạc của 4 đĩa ở hai độ pha loãng được đếm n1 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất (2 đĩa)

n2 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai (2 đĩa) d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất. V- thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

.4.3.2. Phương pháp xác định và tính số lượng E.coli

* Nguyên tắc

Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 370C trong 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng.

* Các bước tiến hành

Bước 1: Lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: Đồng nhất mẫu và pha loãng

Đồng nhất mẫu:

Cân 1g thịt cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào dung dịch đệm pepton, tiến hành giã nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1.

Pha loãng mẫu:

Bước 3: Nuôi cấy dịch mẫu

Đổ môi trường thạch dinh dưỡng Eosin Methylene Blue (EMB) đã hấp vô trùng, để nguội 450C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi đổ ra đĩa petri, mỗi đĩa từ 12 -15ml, sau đó để các đĩa đông tự nhiên.

Chọn 2 độ pha loãng liên tiếp, dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy lên 2 đĩa petri. Sau khi hút dịch mẫu ra môi trường thì dùng que dàn, dàn mẫu để mẫu phân tán đều vào môi trường, lật ngược đĩa và để vào tủ ấm ở 36 – 380C trong 24 - 48 giờ.

Quá trình phân tích chỉ tiêu E. coli được tóm tắt theo quy trình sau:

Bước 4: Đọc kết quả

Sau 24 giờ nuôi cấy mang ra đọc kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli trên môi trường EMB có màu tím ánh kim. Chỉ tính kết quả khi sự phân bố khuẩn lạc trên các đĩa là hợp lý với mối tương quan giữa độ pha loãng và số khuẩn lạc mọc trên đó.

Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 30 – 300 để tính kết quả.

Số vi khuẩn E. coli trong 1g sản phẩm được tính theo công thức sau:

X= C

(n1 + 0,1n2) dV Trong đó:

 C - tổng số khuẩn lạc của 4 đĩa ở hai độ pha loãng được đếm n1 - số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất (2 đĩa)

2.4.3.3. Phương pháp phát hiện Salmonella

* Nguyên tắc

Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình gồm

Mẫu - pha loãng mẫu có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,…

Đổ 10-15ml môi trường EMB đã hấp tiệt trùng vào các đĩa petri

Nuôi ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ Đếm và tính kết quả (CFU/g) hoặc CFU/ml) Chọn các nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 0,1ml

4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterrobateriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.

Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ các nồng độ pha loãng khác nhau, sau khi nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ.

* Các bước tiến hành

Bước 1: Lấy mẫu theo QCVN 01 – 04: 2009 Bước 2: Đồng nhất mẫu và pha loãng

Cân 25g thực phẩm (thịt tươi) cho vào cối đã được tiệt trùng. Sau đó cho thêm vào 225ml dung dịch đệm Peptone, tiến hành giã nhỏ thịt, ta thu được độ pha loãng 10-1

. Chuẩn bị các ống eppendorf và các micropipette vô trùng. Dịch mẫu pha loãng được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipet với đầu vô trùng chuyển 0,1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch đệm, trộn đều mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy trộn (vortex) ta có được độ pha loãng 10-2

. Tiếp tục thực hiện tương tự để có độ pha loãng cần thiết.

Bước 3: Nuôi cấy mẫu

Dùng micropipet với đầu vô trùng hút 1ml mẫu ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào môi trường canh thang. Lắc nhẹ nhiều lần để mẫu phân tán đều vào môi trường, bỏ vào tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ.

Đổ môi trường thạch dinh dưỡng Salmonella- Shigella Agar (SS agar) đã hấp vô trùng, để nguội 450C, trộn đều bằng cách xoay ngược chiều nhiều lần nhẹ nhàng rồi để các đĩa đông tự nhiên.

Dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa petri. Dùng que dàn, dàn mẫu để mẫu phân tán đều vào môi trường, lật ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24 – 48 giờ.

Sau 24 giờ đọc kết quả, dùng que cấy bắt những khuẩn lạc nghi ngờ để thực hiện kỹ thuật cấy thuần.

Bước 4: Đọc kết quả

Sau 24 - 48 giờ mang các đĩa petri đã cấy vi khuẩn ra đọc kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn Salmonella trên môi trường thạch SS agar có tâm màu đen, viền màu hồng Quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, không cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu.

2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Số liệu được nhập và xử lý sơ bộ trên phần mềm Excel theo phương pháp thống kê mô tả; t - Test: Two -Sample assuming unequal variances; và phần mềm kiểm định tỷ lệ thống kê EpiCalc200.

Các giá trị được biểu thị dưới dạng giá trị % và giá trị trung bình (CFU/g). Tỷ lệ mẫu không đạt tiêu chuẩn = Số mẫu không đạt tiêu chuẩn/ tổng số mẫu kiểm tra.

Các giá trị được coi là khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p≤0,05 (độ tin cậy 95%).

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. THỰC TRẠNG HOẠT ĐỘNG CƠ SỞ GIẾT MỔ TRÊN ĐỊA BÀN HUYỆN TÂY SƠN, TỈNH BÌNH ĐỊNH TÂY SƠN, TỈNH BÌNH ĐỊNH

3.1.1. Số lượng và quy mô của các cơ sở giết mổ lợn tại huyện Tây Sơn

Sau khi tiến hành điều tra thực trạng số lượng và quy mô giết mổ của các CSGM lợn tại huyện Tây Sơn, tỉnh Bình Định, có được kết quả tổng hợp ở bảng 3.1:

Bảng 3.1. Khảo sát về số lượng và quy mô các cơ sở giết mổ

TT Địa điểm ∑ cơ sở giết mổ

∑ con giết mổ/ngày đêm

Quy mô giết mổ trung bình (con/ngày đêm) 1 Xã Bình Nghi 4 4 1 2 Xã Bình Hòa 5 15 3 3 Xã Bình Thuận 1 2 2 4 Xã Bình Tân 1 1 1 5 Xã Bình Thành 1 2 2 6 Xã Tây Phú 4 4 1 7 Xã Tây Thuận 3 3 1 8 Xã Tây An 1 2 2 9 Xã Tây Giang 4 4 1 10 Xã Tây Bình 6 12 2 11 Xã Tây Vinh 2 4 2 12 Thị trấn Phú Phong 22 55 3 13 Xã Bình Tường 0 0 0 14 Xã Tây Xuân 0 0 0 15 Xã Vĩnh An 0 0 0 TỔNG CỘNG 54 108 21

Hiện nay, trên địa bàn huyện Tây Sơn vẫn chưa xây dựng được CSGM mổ tập trung nào, nên đã dẫn đến sự xuất hiện các điểm giết mổ theo hộ gia đình, tự phát,

PHẠM VI ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU