Ban đầu, chính quyền Việt Nam Cộng hịa vẫn duy trì tên gọi là tỉnh Mỹ Tho và tỉnh Gị Cơng như thời Pháp thuộc. Ngày 22 tháng 10 năm 1956, Tổng thống Việt Nam Cộng hịa là Ngơ Đình Diệm ban hành sắc lệnh số 143/NV về thay đổi địa giới và tên đơ thành Sài Gịn và các tỉnh tại Việt Nam. Địa giới và địa danh các tỉnh ở
miền Nam thay đổi nhiều, một số tỉnh mới được thành lập. Theo sắc lệnh này, địa phận miền Nam Việt Nam của Việt Nam Cộng hịa gồm đơ thành Sài Gịn và 22 tỉnh, tỉnh Định Tường được thành lập trên phần đất tỉnh Mỹ Tho (trừ vùng nằm phía nam sơng Tiền Giang là quận An Hĩa thì đổi tên thành quận Bình Đại và nhập vào tỉnh Kiến Hịa) và tỉnh Gị Cơng cũ. Tỉnh lị tỉnh Định Tường đặt tại Mỹ Tho và vẫn giữ nguyên tên là “Mỹ Tho”. Ngày 24 tháng 4 năm 1957, chính quyền Việt Nam Cộng hịa ấn định các đơn vị hành chính trực thuộc tỉnh. Tỉnh Định Tường cĩ tỉnh lị đặt tại Mỹ Tho, bao gồm 7 quận ban đầu là Châu Thành, Chợ Gạo, Bến Tranh, Cái Bè, Cai Lậy, Gị Cơng và Hịa Đồng. Trong đĩ, các quận Bến Tranh, Cai Lậy, Cái Bè, Châu Thành và Chợ Gạo trước năm 1956 cùng thuộc tỉnh Mỹ Tho cũ.
Ngày 20 tháng 12 năm 1963, chính quyền Việt Nam Cộng hịa quyết định tái lập tỉnh Gị Cơng, tách từ tỉnh Định Tường. Khi mới tái lập, tỉnh Gị Cơng gồm 2 quận là Châu Thành (đổi tên từ quận Gị Cơng) và Hịa Đồng. Năm 1965, chính quyền Việt Nam Cộng hịa sắp xếp hành chính, chia lại tỉnh Gị Cơng thành 4 quận bao gồm Hịa Đồng, Hịa Lạc, Hịa Tân, Hịa Bình. Ngày 30 tháng 9 năm 1970, Thủ tướng Việt Nam Cộng hịa ban hành Sắc lệnh số 114/SL-NV cải biến xã Điều Hịa thuộc quận Châu Thành thành thị xã Mỹ Tho, là thị xã tự trị trực thuộc chính quyền Việt Nam Cộng hịa, đồng thời kiêm tỉnh lị tỉnh Định Tường. Từ đĩ cho đến năm 1975, thị xã Mỹ Tho, tỉnh Định Tường và tỉnh Gị Cơng là ba đơn vị hành chính cấp tỉnh ngang bằng nhau theo sự phân chia sắp xếp hành chính của Việt Nam Cộng hịa.
Về chính quyền cách mạng (Chính phủ Cách mạng lâm thời Cộng hịa Miền Nam Việt Nam hay Việt Nam Dân chủ Cộng hịa) trong giai đoạn này, khơng cơng nhận tên gọi tỉnh Định Tường và vẫn giữ tên tỉnh cũ là tỉnh Mỹ Tho. Năm 1957, chính quyền cách mạng nhập 2 tỉnh Gị Cơng và Mỹ Tho làm một đơn vị và gọi là tỉnh Mỹ Tho, bao gồm thị xã Mỹ Tho và các huyện Cái Bè, Cai Lậy, Châu Thành, Chợ Gạo, Gị Cơng. Trong giai đoạn từ năm 1964 - 1968, địa bàn tỉnh Gị Cơng của chính quyền Việt Nam Cộng hịa vẫn do huyện Gị Cơng thuộc tỉnh Mỹ Tho của chính quyền cách mạng quản lí. Nhưng đến tháng 8 năm 1968, huyện Gị Cơng lại được chính quyền Mặt trận dân tộc giải phĩng miền Nam Việt Nam tách
khỏi tỉnh Mỹ Tho để lập lại tỉnh Gị Cơng. Năm 1967, Trung ương cục miền Nam đã chuẩn y tách thị xã Mỹ Tho ra khỏi tỉnh Mỹ Tho, đồng thời nâng thị xã lên thành Thành phố Mỹ Tho trực thuộc Khu 8, là một đơn vị hành chính ngang bằng với tỉnh Mỹ Tho. Như vậy, cho đến năm 1976, tỉnh Mỹ Tho, tỉnh Gị Cơng và thành phố Mỹ Tho là 3 đơn vị hành chính ngang bằng nhau.
Chính quyền quân quản Cộng hịa miền Nam Việt Nam lúc bấy giờ vẫn duy trì ba đơn vị hành chính cấp tỉnh ngang bằng nhau là tỉnh Mỹ Tho, tỉnh Gị Cơng và thành phố Mỹ Tho cho đến đầu năm 1976. Lúc này, chính quyền Cách mạng cũng bỏ tên gọi “quận”cĩ từ thời Pháp thuộc và lấy tên gọi “huyện” (quận và phường dành cho các đơn vị hành chánh tương đương khi đã đơ thị hĩa). Bên cạnh đĩ, chính quyền Cách mạng cũng tách một phần đất đai thuộc tỉnh Kiến Tường để sáp nhập vào địa bàn tỉnh Mỹ Tho lúc bấy giờ.
Ngày 20 tháng 9 năm 1975, Bộ Chính trị ra Nghị quyết số 245-NQ/TW về việc hợp tỉnh trong tồn quốc nhằm xây dựng các tỉnh thành những đơn vị kinh tế, kế hoạch và đơn vị hành chính cĩ khả năng giải quyết đến mức cao nhất những yêu cầu về đẩy mạnh sản xuất, tổ chức đời sống vật chất, văn hĩa của nhân dân, về củng cố quốc phịng, bảo vệ trị an, và cĩ khả năng đĩng gĩp tốt nhất vào sự nghiệp chung của cả nước. Theo Nghị quyết này, tỉnh Long An, tỉnh Bến Tre, tỉnh Mỹ Tho, tỉnh Gị Cơng và thành phố Mỹ Tho sẽ hợp nhất lại thành một tỉnh, tên gọi tỉnh mới cùng với nơi đặt tỉnh lị sẽ do địa phương đề nghị lên. Nhưng đến ngày 20 tháng 12 năm 1975, Bộ Chính trị lại ra Nghị quyết số 19/NQ điều chỉnh lại việc hợp nhất tỉnh ở miền Nam Việt Nam cho sát với tình hình thực tế, theo đĩ tỉnh Mỹ Tho, tỉnh Gị Cơng và thành phố Mỹ Tho được tiến hành hợp nhất lại thành một tỉnh. (Trần Hồng Diệu, Nguyễn Anh Tuấn, 2005).