Thế giới:
Nhìn chung, men vi sinh đã được áp dụng trong bể nuôi, trong ao để hạn chế sự nhiễm bệnh đối với các vi khuẩn gây bệnh, mặc dù ảnh hưởng về dinh dưỡng cũng đóng vai trò trong men vi sinh, đặc biệt là việc sử dụng dinh dưỡng mang lại tác dụng làm sạch môi trường. Hầu hết men vi sinh sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học trong nuôi trồng thủy sản là vi khuẩn lactic acid (Lactobacillus, Carnobacterium, ...), rgiống Vibrio (Vibrioalginolyticus, ...), giống Bacillus hoặc giống Pseudomonas.
Verschuere và cộng sự (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp. đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước, do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2. Vì vậy, Bacillus sp. giúp giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan [44].
Boyd và cộng sự (1996) đã công bố việc thử nghiệm thành công khi sử dụng kết hợp các chủng vi sinh vật: Bacillus subtilis, Nitrobacter, Aerobacter, Cellulomonas và Rhodopseudomonas trong các ao nuôi thủy sản. Kết quả là các ao nuôi thử nghiệm không còn mùi hôi, giảm hàm lượng mùn bã hữu cơ, giảm lượng tảo lam và các hợp chất Nitơ liên kết như: Nitrit (N-NO2) và Amoni (N-NH4), giảm nồng độ H2S, P2O5… giúp ổn định môi trường ao nuôi và tăng sức đề kháng cho
tôm cá nuôi, đồng thời hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh trong ao nuôi [40].
Hossain và cộng sự (2013), nghiên cứu thực hiện trong 138 ngày đánh giá tỷ lệ tăng trưởng và tỷ lệ sống của P. monodon bằng chế phẩm sinh học. Độ trong suốt, độ mặn, pH, oxy hòa tan (DO), nhiệt độ, tổng đạm amon (TAN) được ghi lại bằng các phép đo chuẩn. Trọng lượng cơ thể cuối cùng trung bình của tôm thu hoạch là 37,67 ± 1,15 g trong ao probiotic và 27,33 ± 0,58 g trong ao đối chứng. Tỷ lệ sống trung bình là 90,67 ± 1,15% trong ao probiotic và 71,00 ± 3,0% trong ao đối chứng. Tăng trọng trung bình hàng ngày (ADG) là 0,27 ± 0,01 g trong ao probiotic và 0,19 ± 0,01 g ao đối chứng. Kết quả cho thấy rằng probiotic đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì các thông số chất lượng nước, chất lượng đất và quản lý sức khỏe cũng như tăng sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm [45].
Theo Kumar và cộng sự (2016), hiệu quả probiotic phụ thuộc vào nhiều yếu tố như liều lượng sử dụng, thời gian sử dụng và chu trình sử dụng được thể hiện qua nghiên cứu ở tôm nuôi, L. Plantarum kích thích tăng cường hệ thống phenoloxidase (PO), prophenoloxidase (ProPO), superoxide dismuatase (SOD) và loại bỏ V. alginolyticus khi vi khuẩn có lợi này được cho vào thức ăn 1010 CFU/kg trong 168 giờ [39].
Gustavo Pinoargote and Sadhana Ravishankar (2018)đưa ra báo cáo về “Đánh giá hiệu quả của probiotic trong thí nghiệm đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm”. Probiotic có thể cung cấp một phương pháp hiệu quả để giảm tác động bất lợi của căn bệnh này trong ao nuôi tôm. Nghiên cứu này đã được tiến hành để xác định tác dụng ức chế của probiotic đối với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra AHPND. Các giải pháp probiotic bao gồm: Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae, và Rhodopseudomonas palustris riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau thử nghiệm với V. parahaemolyticus.
Kết quả từ thử nghiệm cho thấy các giải pháp probiotic bao gồm L. casei, sự kết hợp của L. casei và R. palustris, và sự kết hợp của L. casei, S. cerevisiae và R. palustris có khả năng ức chế AHPND trong nuôi tôm. Nghiên cứu hiện tại cho thấy
rằng sự kết hợp của một số chế phẩm sinh học có thể có hiệu quả bước hướng tới giảm thiểu tác động bất lợi của cấp bệnh hoại tử gan tụy trong nuôi tôm. Theo đó, mục tiêu của nghiên cứu này là xác định tác dụng ức chế của probiotic cũng như sự chuyển hóa của chúng đối với chủng V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trong thí nghiệm [42].
Việt Nam:
Theo Võ Thị Thứ và cộng sự (2004) thử nghiệm men vi sinh Biochie để xử lý nước nuôi của tôm sú giống và tôm thịt tại Đồ Sơn, Hải Phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt thông qua môi trường được cải thiện, đặc biệt rất có hiệu quả đối với nuôi tôm giống như giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi. Tác dụng của chế phẩm lên sự tăng trưởng rất khả quan là tôm phát triển đồng đều, tăng tỉ lệ sống của tôm và tôm tăng trưởng nhanh [46].
Theo Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và cộng sự (2010), nghiên cứu cho ra sản phẩm BioShrimp-RIA2 và BioFish-RIA2 bao gồm 4 chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans, Bacillaceae bacterium, Enterobacter cancerous, Pantoea stewartii có khả năng ức chế giảm độc lực của nhóm vi khuẩn Vibrio và giảm mật độ Vibrio khi thử nghiệm trên ấu trùng cá chẽm và tôm sú. Kết quả cho thấy nâng cao tỷ lệ sống của cá chẽm từ 7 – 10% và tôm sú 10% [47].
Nguyễn Ngọc Vĩnh (2012) với đề tài “Đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm sinh học EM đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống và khả năng kháng bệnh của tôm chân trắng (Penaeus vannamei) nuôi tại huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng”. Kết quả thấy rằng các yếu tố pH, nhiệt độ và độ mặn khá ổn định ở các ao nuôi sử dụng chế phẩm sinh học ổn định hơn so với đối chứng không sử dụng chế phẩm sinh học. Tại những thời điểm kiểm tra khác nhau sau 30 ngày, 45 ngày và 60 ngày nuôi, tốc độ tăng trưởng về trọng lượng và chiều dài của tôm trong ao nuôi tôm có bổ sung chế phẩm sinh học tăng nhanh hơn so với ao nuôi không sử dụng chế phẩm sinh học. Điều này được thể hiện rõ nhất trong lần kiểm tra cuối cùng với trọng lượng (16,93g/con) và chiều dài (13,22 cm/con), trong khi đó ao nuôi không sử dụng chế phẩm sinh học đạt trọng lượng thấp hơn (13,84 g/con) và chiều dài (12,76 cm/con) [40].
Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự (2014), Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM nghiên cứu chế phẩm Probact dùng trộn thức ăn của tôm và Ecobact dùng để xử lý môi trường nước trong ao nuôi tôm. Kết quả làm giảm vi sinh vật gây bệnh Vibrio
cho tôm, cải thiện chất lượng nước và bùn trong ao nuôi tôm, tăng tính miễn dịch cho tôm. Các chế phẩm này được sử dụng tại các nông hộ nuôi tôm ở Cần Giờ, Nhà Bè và các tỉnh ĐBSCL cho kết quả tôm ít bệnh, tăng trưởng tốt năng suất thu hoạch tăng từ 30 – 45% [48].
Năm 2017, tác giả Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và cộng sự đã tiến hành đề tài “Đánh giá tình hình sử dụng chế phẩm vi sinh trong nuôi tôm ở Đồng bằng sông Cửu Long” tại 93 hộ nuôi tôm ở 3 tỉnh Cà Mau, Bến Tre và Bạc Liêu. Kết quả khảo sát cho thấy đa số các hộ đều nhận thức được tầm quan trọng của việc sử dụng chế phẩm vi sinh (CPVS) trong nuôi tôm. Đa số các hộ đánh giá việc sử dụng CPVS có hiệu quả tốt. Các dòng CPVS sử dụng trong nuôi tôm bao gồm CPVS xử lý chất hữu cơ. CPVS xử lý khí độc ở đáy ao, CPVS đối kháng Vibrio gây bệnh, CPVS bổ sung vào thức ăn. Tuy nhiên, những kết quả ở 93 hộ nuôi tôm cho thấy chế phẩm vi sinh không phải là yếu tố duy nhất quyết định đến năng suất và tỉ lệ sống của các mô hình nuôi tôm. Các yếu tố khác cần phải lưu ý bao gồm chất lượng con giống, kỹ thuật nuôi và các biện pháp quản lý môi trường và sức khỏe tôm nuôi, nhằm đảm bảo cho sự thành công của nghề nuôi tôm [49].
Kể từ khi tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp được xác định, đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đối với bệnh này nhưng thực tế cho thấy các giải pháp ức chế bệnh AHPND chưa cụ thể và rõ ràng. Theo tổng cục thủy sản thì 5 tháng đầu năm 2017 diện tích nuôi tôm cả nước bị bệnh gan tụy cấp là 1.557 ha, chiếm khoảng 13,6% trong đó các tỉnh thiệt hại là Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Bến Tre, Kiên Giang, ... Điều này cho thấy bệnh hoại tử gan tụy cấp vẫn còn xuất hiện ở một tỷ lệ đáng lo ngại đòi hỏi cần phải sớm có giải pháp cho bệnh nguy hiểm này nhằm góp phần làm ổn định năng cho nghề nuôi tôm của Việt Nam.
Trong những năm gần đây, việc sử dụng chế phẩm vi sinh (probiotic) trở thành hướng tiếp cận đầy hứa hẹn trong nuôi trồng thủy sản để giảm thiểu các tác động của AHPND [4], đặc biệt là đối với ngành nuôi tôm ở nước ta. Bên cạnh đó,
dù đã có nhiều nghiên cứu bài bản để đưa ra các sản phẩm có khả năng ức chế với vi khuẩn Vibrio sp. nhưng chưa có công trình nghiên cứu nào đưa ra kết quả ứng dụng sản phẩm vi sinh có khả năng ức chế đặc hiệu với vi khuẩn gây bệnh AHPND. Hơn thế nữa, chế phẩm vi sinh cũng có thể ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật bản địa nếu không được quản lý, giám sát chặt chẽ. Các vi sinh vật trong chế phẩm tạo ra một hệ thống vi sinh thái khác nhau, hỗ trợ lẫn nhau. Chính vì thế hoạt động tổng hợp của chúng sẽ đem lại hiệu quả cao nhằm kiểm soát dịch bệnh, tăng cường miễn dịch, men tiêu hóa, góp phần cải thiện chất lượng nước, ổn định pH, hạn chế ô nhiễm môi trường nước, đất giúp người nuôi tôm được hiệu quả kinh tế cao và bền vững.
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian, địa điểm, vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 09/2018 -09/2019.Bao gồm thời gian nghiên cứu tài liệu, khảo sát các phương pháp sử dụng chế phẩm probiotic hiệu quả trên tôm sú và tôm thẻ (09/2018 - 01/2019), ứng dụng chế phẩm probiotic trên mô hình ao nuôi tôm sú, tôm thẻ (02/2019 - 07/2019), phân tích mẫu, phân tích số liệu và viết báo cáo.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Trung tâm quan trắc môi trường và bệnh thủy sản Nam bộ - Viện Nghiên cứunuôi trồng thủy sản II: 116 Nguyễn Đình Chiểu, Phường Đa Kao, Quận 1, TP.Hồ Chí Minh và Cơ sở nghiên cứu thực nghiệm: 2171 Lê Đức Thọ, Phường 13, Quận Gò Vấp, thành phố Hồ Chí Minh.
Mô hình ao nuôi tôm ở Trung tâm tập huấn và chuyển giao công nghệ nông nghiệp vùng đồng bằng sông Cửu Long, ấp Nopoul, xã Vĩnh Tân, thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng.
2.1.3. Các thiết bị, vật liệu dùng trong thí nghiệm
Các thiết bị tăng sinh vi khuẩn và phân tích chất lượng nước: Bình erlen, tủ hấp, tủ lắc, tủ cấy vô trùng, máy ly tâm, quang phổ kế UV-VIS.
Các bể composite và bể nhựa dùng cho thí nghiệm, máy sục khí, các thiết bị công trình trong ao nuôi thử nghiệm như hệ thống quạt, hệ thống sục khí, máy bơm các loại, …
Tôm sú và tôm thẻ chân trắng được dùng để nuôi thử nghiệm trọng lượng 1- 3g/ con, tôm postlarvae 12 ngày tuổi (PL12) được dùng trong mô hình nuôi thử nghiệm.
Chế phẩm sinh học chứa từng loại vi khuẩn có lợi Bacillus licheniformis B1 (mật độ 109 CFU/g), B. subtilis S5(mật độ 109 CFU/g); Streptomyces X285 (108 CFU/g); vi khuẩn gây AHPND Vibrioparahaemolyticus thuộc phạm vi đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng Vibrio spp. gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng” – Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II.
Chủng B1 có nguồn gốc từ ruột cá đối (Mugil cephalus) cá tự nhiên, S5 phân lập từ mẫu bùn ao nuôi quảng canh cải tiến tỉnh Sóc Trăng, X285 phân lập được từ mẫu bùn ao nuôi tôm lúa Bạc Liêu. Các chủng này cho kết quả vòng kháng V. parahaemolyticus đạt trên 15 mm và ổn định trong 24 giở khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch; như Hình 2.1 cho thấy Bacillus B1, S5 có vòng kháng V. parahaemolyticus khoảng 15 mm; Streptomyces dao động từ 30 đến 50 mm ổn định 48 giờ.
Hình 2.1.Kết quả đối kháng khuếch tán đĩa của các chủng Bacillus B1, Bacillus
S5 và Streptomyces X285 với VP được tuyển chọn 2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định liều gây chết trung bình (LD50) của vi khuẩn V. parahaemolyticus đối với tôm thử nghiệm V. parahaemolyticus đối với tôm thử nghiệm
Trước tiên tôm được chọn lọc 15 con/ bể, trọng lượng trung bình 3g/ con, làm thuần và ổn định trong bể thí nghiệm có dung tích 90L có sục khí liên tục trước thời gian thí nghiệm 1 tuần. Siphon cấp thêm nước hằng ngày. Cho tôm ăn bằng 2,5% trọng lượng cơ thể với thức ăn viên Đài Loan có thành phần đạm 55%, béo 8%, xơ 2,5%, tro 13%, độ ẩm 8%. Tôm được kiểm tra các tác nhân gây bệnh thông thường như: WSSV, TSV, YHV, IMNV, IHHNV, Vibrio phát sáng và V. parahaemolyticus
trước khi thí nghiệm. Dựa theo phương pháp mô tả của Reed và Muench (1983) [50].
Thí nghiệm được bố trí với các nghiệm thức khác nhau được thể hiện bảng 2.1, mỗi nghiệm thức được lặp lại 2 lần.
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 của V.parahaemolyticus đối với tôm STT Nghiệm thức Nồng độ vi khuẩn gây bệnh (CFU/mL) Số lượng 1 Tôm sú (3g) 103, 104, 105, 106 2 bể x 15 con/bể x 4 nồng độ 2 Tôm sú (3g) 103, 104, 105, 106 2 bể x 15 con/bể x 4 nồng độ
Tôm được gây nhiễm bằng phương pháp ngâm [30]. Chuẩn bị vi khuẩn V. parahaemolyticus gây cảm nhiễm: V. parahaemolyticus gây AHPND được cấy trên đĩa thạch TCBS ủ 28oC trong 24 giờ. Sau đó, huyền phù một khuẩn lạc đơn trong môi trường Nutrient Broth bổ sung 1,5% NaCl (NB+). Dựa vào phương trình tương quan giữa mật độ quang OD550nm và mật độ vi khuẩn V. parahaemolyticus được khảo sát trong thí nghiệm thì 1 OD550nm= 5,58 x 108 tế bào/ mL (Phụ lục 2).Mật độ vi khuẩn V. parahaemolyticus được gây cảm nhiễm trong các nghiệm thức 106 CFU/mL.
Thí nghiệm được thực hiện với các nghiệm thức nồng độ khác nhau. Mỗi nghiệm thức thử nghiệm với 15 tôm trong 20L nước, vi khuẩn được điều chỉnh đúng với mật độ khảo sát. Thí nghiệm ghi nhận biểu hiện tôm, số lượng tôm chết hằng ngày. Tôm chết được loại ra khỏi bể nuôi kịp thời để tránh trường hợp tôm chết lâu làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước thí nghiệm.
Ngoài ra, thu mẫu tôm lờ đờ có dấu hiệu ngoài đặc trưng của bệnh AHPND cấy ria trực tiếp trên môi trường TCBS hoặc Chromagar kiểm tra lại sự hiện diện của V. parahaemolyticusgây AHPND bằng phương pháp PCR. Ngoài ra, các mẫu tôm lờ đờ ở các nghiệm thức được cố định trong dung dịch Davidson chuyển về phòng thí nghiệm phân tích mô bệnh học.
Thống kê số tôm chết và số tôm sống trong mỗi nghiệm thức để đánh giá LD50 theo công thức:
𝐿𝐷50 = 10(𝑎−𝑃𝐷) 𝑣à 𝑃𝐷 = 𝑃𝑎 − 50 𝑃𝑎 − 𝑃𝑢
Trong đó: 10a là nồng độ tại đó tôm thí nghiệm chết trên 50% PD: khoảng cách tỷ lệ
Pa: tỷ lệ tôm chết cộng dồn cận trên của tỷ lệ tôm chết cộng dồn trung bình là 50%
Pu: Tỷ lệ tôm chết cộng dồn cận dưới của tỷ lệ tôm chết cộng dồn trung bình 50%
2.2.2. Phương pháp thử nghiệm sử dụng probiotic hiệu quả
2.2.2.1. Phương pháp tăng sinh các chủng vi sinh trong chế phẩm sinh học Bacillus B1, S5 và Streptomyces X285
Chế phẩm Bacillus B1 và Bacillus S5 có mật độ Bacillus ban đầu khoảng 2x109 CFU/g; chế phẩm Streptomyces X285 mật độ ban đầu 108 CFU/mL trước khi sử dụng được hoạt hóa và tăng sinh theo công thức sau: bột đậu nành (2g/L), mật rỉ đường (7g/L), cao nấm men (0,5 g/L), chế phẩm Bacillussử dụng trong ao (1g/m3), chế phẩm Streptomyces X285 (1g/m3).
Hai nhóm vi sinh này được nhân sinh khối từng mẻ trong đó sản phẩm
Bacillus được tăng sinh thời gian 18-24 giờ; nhóm Streptomyces được tăng sinh thời gian 60-72 giờ sục khí liên tục trước khixử lý nước định kỳ trong các thí nghiệm.
Với công thức môi trường nhân sinh khối từ sản phẩm trên thì thu được dịch vi sinh vật có lợi tương ứng Bacillus (B1, S5) 109 CFU/mL và Streptomyces X285 là 107 - 108 CFU/mL.
2.2.2.2. Thí nghiệm thăm dò liều sử dụng chế phẩm hiệu quả bằng phương pháp cho ăn và phương pháp xử lý nước
Mục tiêu của nghiên cứu nhằm đánh giá phương pháp cho ăn hay xử lý nước mang lại hiệu quả trong phòng bệnh gan tụy cấp trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng.
Tôm sú/ tôm thẻ (tôm) được bố trí thí nghiệm trong các bể composite thể tích 50 lít chứa 30 lít nước biển sạch độ mặn 20 ‰. Tôm khỏe (2-3 gram) được thuần tại trại giống Vũng Tàu sau đó đưa về phòng thí nghiệm nuôi trong bể sục khí liên tục.