2.2.2.1. Phương pháp tăng sinh các chủng vi sinh trong chế phẩm sinh học Bacillus B1, S5 và Streptomyces X285
Chế phẩm Bacillus B1 và Bacillus S5 có mật độ Bacillus ban đầu khoảng 2x109 CFU/g; chế phẩm Streptomyces X285 mật độ ban đầu 108 CFU/mL trước khi sử dụng được hoạt hóa và tăng sinh theo công thức sau: bột đậu nành (2g/L), mật rỉ đường (7g/L), cao nấm men (0,5 g/L), chế phẩm Bacillussử dụng trong ao (1g/m3), chế phẩm Streptomyces X285 (1g/m3).
Hai nhóm vi sinh này được nhân sinh khối từng mẻ trong đó sản phẩm
Bacillus được tăng sinh thời gian 18-24 giờ; nhóm Streptomyces được tăng sinh thời gian 60-72 giờ sục khí liên tục trước khixử lý nước định kỳ trong các thí nghiệm.
Với công thức môi trường nhân sinh khối từ sản phẩm trên thì thu được dịch vi sinh vật có lợi tương ứng Bacillus (B1, S5) 109 CFU/mL và Streptomyces X285 là 107 - 108 CFU/mL.
2.2.2.2. Thí nghiệm thăm dò liều sử dụng chế phẩm hiệu quả bằng phương pháp cho ăn và phương pháp xử lý nước
Mục tiêu của nghiên cứu nhằm đánh giá phương pháp cho ăn hay xử lý nước mang lại hiệu quả trong phòng bệnh gan tụy cấp trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng.
Tôm sú/ tôm thẻ (tôm) được bố trí thí nghiệm trong các bể composite thể tích 50 lít chứa 30 lít nước biển sạch độ mặn 20 ‰. Tôm khỏe (2-3 gram) được thuần tại trại giống Vũng Tàu sau đó đưa về phòng thí nghiệm nuôi trong bể sục khí liên tục.
cho ăn probiotic như Bảng 2.2 liên tục trong 14 ngày trước khi gây nhiễm với V. parahaemolyticus đối với phương pháp cho ăn. Phương pháp xử lý nước thì các nghiệm thức thí nghiệm được xử lý 2 lần/ tuần trước khi gây nhiễm. Các nghiệm thức được lặp lại 03 lần và các bể được theo dõi liên tục 10 ngày sau khi gây nhiễm.
Chuẩn bị vi khuẩn V. parahaemolyticustương tự mục 2.2.1
Vi sinh trước khi sử dụng được lên men theo công thức trongmục 2.2.2.1
Bảng 2.2. Thí nghiệm sử dụng chế phẩm probiotic bằng phương pháp cho ăn và phương pháp xử lý nước
Phương pháp sử
dụng probiotic Nghiệm thức Mật độ vi khuẩn
Thời gian sử dụng
Cho ăn
BacillusB1 10
7 CFU/g thức ăn 3 lần/ngày 108 CFU/g thức ăn 3lần/ngày
BacillusS5 10
7 CFU/g thức ăn 3 lần/ngày 108 CFU/g thức ăn 3 lần/ngày
Streptomyces X285 10
7 CFU/g thức ăn 3 lần/ngày 108 CFU/g thức ăn 3 lần/ngày
Đối chứng (ĐC) - 3 lần/ ngày
Xử lý nước BacillusB1 105 CFU/mL 2 lần/tuần
BacillusS5 105 CFU/mL 2 lần/tuần
Streptomyces X285 104 CFU/mL 2 lần/tuần Bac B1-Strep X (B1-X285) 105-104 CFU/mL 2 lần/tuần Bac S5- StrepX (S5-X285) 105-104 CFU/mL 2 lần/tuần Đối chứng - -
Ghi chú: nghiệm thức đối chứng: tôm được cho ăn thức ăn và nuôi trong điều kiện không sử dụng chế phẩm vi sinh
Tôm cảm nhiễm sẽ được ghi nhận tỷ lệ chết hằng ngày và liên tục trong 10 ngày đến khi không còn hiện tượng chết.
Sau đó đánh giá tỷ lệ bảo hộ (relative percent survival – RPS) dựa theo công thức của Amend (1981):
RPS % = 1 − (A/B) x 100% Trong đó:
A:là phần trăm tôm chết ở nhóm phối trộn thức ăn và gây nhiễm V. parahaemolyticus.
B: là phần trăm tôm chết ở nhóm đối chứng V. parahaemolyticus.
2.2.2.3. Phương pháp khảo sát tần suất sử dụng chế phẩm probiotic trong điều kiện phòng thí nghiệm
Mục tiêu: đánh giá thời gian xử lý nước hiệu quả nhằm kiểm soát được V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND
Tôm thẻ, tôm sú khỏe trọng lượng 1,5-2 g/con được bố trí vào các bể nhựa (composite) tròn (500 lít) chứa 350 lít nước biển (độ măn 15-20 ‰) có sục khí liên tục. Mỗi nghiệm thức bố trí 100 tôm/bể cho ăn 3 lần/ ngày, được lặp lại 3 lần. Định kỳ xử lý vi sinh và duy trì mật độ Bacillus tương ứng 105 CFU/mL và Streptomyces
X285 104 CFU/mLtrong các nghiệm thức xừ lý vi sinh theo Bảng 2.3. Các nghiệm thức sau khi xử lý probiotic một ngày theo bố trí Bảng 2.2, tiến hành gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus bằng phương pháp ngâm với mật độ 106 CFU/mL. Phương pháp chuẩn bị vi khuản V. parahaemolyticus gây nhiễm và phương pháp lên men các sản phẩm probiotic được miêu tả mục 2.2.2 và 2.2.2.1.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm tần suất sử dụng probiotic
Nghiệm thức Chủng vi khuẩn sử dụng xử lý nước Tần suất sử dụng NT1 (B-S-X-1) Bacillus(B1,S5)+ Streptomyces X285 1 tuần/ lần NT2 (B-S-X-2) 2 lần/ tuần NT3 (B-S-X-3) 3 lần/ tuần
NT4 (B-S-1) Bacillus B1+ Bacillus S5 1 tuần/ lần
NT5 (B-S-2) 2 lần/ tuần
NT7 (B-X-1) Bacillus B1+ Streptomyces X285 1 tuần/ lần NT8 (B-X-2) 2 lần/ tuần NT9 (B-X-3) 3 lần/ tuần NT10 (S-X-1) Bacillus S5 + Streptomyces X285 1 tuần/ lần NT11 (S-X-2) 2 lần/ tuần NT12 (S-X-3) 3 lần/ tuần Đối chứng dương (ĐC)
2.2.2.4. Thử nghiệm hiệu quả sử dụng probiotic trong mô hình ao nuôi tôm
Dựa vào kết quả thử nghiệm hiệu quả xử lý nước ao nuôi 2 lần/tuần kết hợp giữa các chủng vi sinh vật có lợi (probiotic) trong phòng AHPND trong phòng thí nghiệm xây dựng dự thảo quy trình sử dụng probiotic nhằm ứng dụng quy mô ao nuôi pilot diện tích 600 - 800 m2 tại Trung tâm tập huấn và chuyển giao công nghệ nông nghiệp vùng đồng bằng sông Cửu Long, ấp Nopoul, xã Vĩnh Tân, thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng.
Ao nuôi thẻ được thiết kế phủbạt toàn bộ ao và ao sú chỉ phủ bạt bờ. Hệ thống cấp và thoát nước riêng biệt, hệ thống thu gom chất thải được bố trí giữa ao nhằm định kỳ đưa lượng thức ăn dư thừa và chất thải ra khỏi hệ thống nuôi. Ngoài ra, hệ thống sục khí và quạt được thiết kế nhằm đảm bảo duy trì đủ lượng oxy cho tôm và thu gom chất thải tại các vị trí hố chứa thải trước khi siphon.
Mật độ thả nuôi: 100-120 tôm thẻ/m2 và 30-35 tôm sú/ m2. Tôm postlarvae (PL12) được kiểm tra không mang mầm bệnh như đốm trắng WSSV, đầu vàng (YHD), bệnh còi (MBV), bệnh AHPND, và các mầm bệnh khác trước khi thả.
Số lượng ao thử nghiệm cho đối tượng:
Tôm sú: 2 ao dùng sản phẩm probiotic từ đề tài và 1 ao đối chứng (sản phẩm thương mại).
Tôm thẻ chân trắng: 2 ao dùng sản phẩm probiotic từ đề tài và 2 ao đối chứng (sản phẩm thương mại).
Định kỳ xử lý vi sinh sau khi lên men trong bể nhựa 1m3 tại ao và duy trì mật độ tương ứng Bacillus 105 CFU/mL và Streptomyces X285 104 CFU/mL trong các ao thử nghiệm. Chi tiết bố trí thí nghiệm được thể hiện Bảng 2.4 và 2.5
Bảng 2.4. Bố trí thử nghiệm hiệu quả sử dụng probiotic mô hình ao nuôi tôm thẻ thương phẩm Ao thí nghiệm Chủng vi sinh sử dụng Tần suất sử dụng Liều và cách sử dụng chế phẩm vi sinh Ao 1 (TN1) Hỗn hợp Bacillus (B1, S5) và Streptomyces X285
2 lần/ tuần Lên men sản phẩm trước khi xử lý ao trên bể nhựa (1 m3). Liều dùng 1g sản phẩm/m3 nước ao nuôi Ao 2 (TN2) Ao 3 (ĐC1) Sử dụng chế phẩm vi
sinh thương mại
(Bacillus sp. Rhodobacter sp.) 2 lần/tuần Ao 4 (ĐC2) Sử dụng chế phẩm vi
sinh thương mại
(Bacillus sp.)
1 lần/5 ngày Xử lý trực tiếp sản phẩm liều 0,5-1 g/m3 nước ao nuôi
Ghi chú: Công thức lên men theo mục 2.2.2.1.
Bảng 2.5. Bố trí thử nghiệm hiệu quả sử dụng probiotic mô hình ao nuôi tôm sú thương phẩm Ao thí nghiệm Chủng vi sinh sử dụng Tần suất sử dụng Liều và cách sử dụng chế phẩm vi sinh Kết cấu ao Ao 5 (TN3) Hỗn hợp Bacillus (B1, S5) và Streptomyces X285
2 lần/ tuần Lên men sản phẩm trước khi xử lý ao trên bể nhựa (1 m3). Liều dùng 1g sản phẩm/m3 nước ao nuôi Ao đất Ao 6 (TN4) Ao 7 (ĐC3) Sử dụng chế phẩm vi
sinh thương mại
(Bacillus sp.
Rhodobacter sp.)
Trong quá trình nuôi theo dõi mật độ Vibrio tổng số và V. parahaemolyticus
mẫu nước định kỳ 7 ngày/1 lần. Bên cạnh đó, gen độc PirB của V. parahaemolyticus trong nước ao nuôi được xác địnhbằng phương sinh học phân tửsau khi mẫu nước này được làm giàu trong môi trường dinh dưỡng NB[55].
2.2.2.5. Phương pháp theo dõi và thu mẫu từ ao nuôi
Ao được theo dõi và ghi chép hàng ngày vào sổ nhật ký về lượng thức ăn, xử lý nước, các biểu hiện bất thường tại ao nuôi, theo dõi hàng ngày chỉ tiêu pH, nhiệt độ, độ mặn. Các yếu tố môi trường được kiểm tra hàng tuần gồm nitrite, tổng đạm amon (NH3/NH4+), COD.
2.2.2.6. Phương pháp thu mẫu
Thu mẫu nước: Mẫu nước được thu cách mặt nước 0,5 – 1 m, thu lúc quạt nước ngừngnhằm đảm bảo tính đồng đều của mẫu thu, thu 2 lít nước bảo quản lạnh 4oC và chuyển về phòng thí nghiệm.
2.2.2.7. Phương pháp phân tích mẫu nước
Đối với chỉ tiêu pH,nhiệt độ, độ mặn được kiểm tra tại hiện trường bằng các máy thực địa cầm tay. Các chỉ tiêu còn lạiđược phân tích tại phòng thí nghiệm theo các phương pháp phân tích tiêu chuẩn như Bảng 2.6.
Bảng 2.6. Phương pháp phân tíchmôi trường
STT Thông số Phương pháp phân tích
1 Nhiệt độ Thiết bị chuyên dùng/ đo tại hiện
trường 2 pH 3 Độ mặn 4 N-NO2 SMEWW 4500 NO2- : 2012 5 NH4+/NH3 SMEWW 4500 NH3 F: 2013 6 COD TCVN 6186:1996
2.2.2.8. Phương pháp xác định Vibrio tổng số và V. paraharmolyticus
Tổng số Vibrio trong mẫu nước ao nuôi được xác định bằng phương pháp trải đĩa trên thạch TCBS. Trước hết pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý vô trùng để được dãy nồng độ pha loãng mẫu ở 100, 10-1. Lấy 100 µl mẫu từ các nồng độ này
cấy trên đĩa thạch TCBS (mỗi nồng độ cấy 3 đĩa). Ủ đĩa thạch ở 28-30oC/24h rồi đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch.
Xác định sự hiện diện của V. parahaemolyticus bằng cách cấy mẫu trên môi trường chọn CHROMagarTM Vibrio. V. parahaemolyticus được quan sát trên loại môi trường này khi chúng tạo khuẩn lạc màu tím hoa cà đặc trưng với kích thước 1,5-2 mm sau 24 giờ ủ ở nhiệt độ 28-300C.