Các thiết bị tăng sinh vi khuẩn và phân tích chất lượng nước: Bình erlen, tủ hấp, tủ lắc, tủ cấy vô trùng, máy ly tâm, quang phổ kế UV-VIS.
Các bể composite và bể nhựa dùng cho thí nghiệm, máy sục khí, các thiết bị công trình trong ao nuôi thử nghiệm như hệ thống quạt, hệ thống sục khí, máy bơm các loại, …
Tôm sú và tôm thẻ chân trắng được dùng để nuôi thử nghiệm trọng lượng 1- 3g/ con, tôm postlarvae 12 ngày tuổi (PL12) được dùng trong mô hình nuôi thử nghiệm.
Chế phẩm sinh học chứa từng loại vi khuẩn có lợi Bacillus licheniformis B1 (mật độ 109 CFU/g), B. subtilis S5(mật độ 109 CFU/g); Streptomyces X285 (108 CFU/g); vi khuẩn gây AHPND Vibrioparahaemolyticus thuộc phạm vi đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh đối kháng Vibrio spp. gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng” – Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II.
Chủng B1 có nguồn gốc từ ruột cá đối (Mugil cephalus) cá tự nhiên, S5 phân lập từ mẫu bùn ao nuôi quảng canh cải tiến tỉnh Sóc Trăng, X285 phân lập được từ mẫu bùn ao nuôi tôm lúa Bạc Liêu. Các chủng này cho kết quả vòng kháng V. parahaemolyticus đạt trên 15 mm và ổn định trong 24 giở khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch; như Hình 2.1 cho thấy Bacillus B1, S5 có vòng kháng V. parahaemolyticus khoảng 15 mm; Streptomyces dao động từ 30 đến 50 mm ổn định 48 giờ.
Hình 2.1.Kết quả đối kháng khuếch tán đĩa của các chủng Bacillus B1, Bacillus
S5 và Streptomyces X285 với VP được tuyển chọn 2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định liều gây chết trung bình (LD50) của vi khuẩn V. parahaemolyticus đối với tôm thử nghiệm V. parahaemolyticus đối với tôm thử nghiệm
Trước tiên tôm được chọn lọc 15 con/ bể, trọng lượng trung bình 3g/ con, làm thuần và ổn định trong bể thí nghiệm có dung tích 90L có sục khí liên tục trước thời gian thí nghiệm 1 tuần. Siphon cấp thêm nước hằng ngày. Cho tôm ăn bằng 2,5% trọng lượng cơ thể với thức ăn viên Đài Loan có thành phần đạm 55%, béo 8%, xơ 2,5%, tro 13%, độ ẩm 8%. Tôm được kiểm tra các tác nhân gây bệnh thông thường như: WSSV, TSV, YHV, IMNV, IHHNV, Vibrio phát sáng và V. parahaemolyticus
trước khi thí nghiệm. Dựa theo phương pháp mô tả của Reed và Muench (1983) [50].
Thí nghiệm được bố trí với các nghiệm thức khác nhau được thể hiện bảng 2.1, mỗi nghiệm thức được lặp lại 2 lần.
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm xác định LD50 của V.parahaemolyticus đối với tôm STT Nghiệm thức Nồng độ vi khuẩn gây bệnh (CFU/mL) Số lượng 1 Tôm sú (3g) 103, 104, 105, 106 2 bể x 15 con/bể x 4 nồng độ 2 Tôm sú (3g) 103, 104, 105, 106 2 bể x 15 con/bể x 4 nồng độ
Tôm được gây nhiễm bằng phương pháp ngâm [30]. Chuẩn bị vi khuẩn V. parahaemolyticus gây cảm nhiễm: V. parahaemolyticus gây AHPND được cấy trên đĩa thạch TCBS ủ 28oC trong 24 giờ. Sau đó, huyền phù một khuẩn lạc đơn trong môi trường Nutrient Broth bổ sung 1,5% NaCl (NB+). Dựa vào phương trình tương quan giữa mật độ quang OD550nm và mật độ vi khuẩn V. parahaemolyticus được khảo sát trong thí nghiệm thì 1 OD550nm= 5,58 x 108 tế bào/ mL (Phụ lục 2).Mật độ vi khuẩn V. parahaemolyticus được gây cảm nhiễm trong các nghiệm thức 106 CFU/mL.
Thí nghiệm được thực hiện với các nghiệm thức nồng độ khác nhau. Mỗi nghiệm thức thử nghiệm với 15 tôm trong 20L nước, vi khuẩn được điều chỉnh đúng với mật độ khảo sát. Thí nghiệm ghi nhận biểu hiện tôm, số lượng tôm chết hằng ngày. Tôm chết được loại ra khỏi bể nuôi kịp thời để tránh trường hợp tôm chết lâu làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước thí nghiệm.
Ngoài ra, thu mẫu tôm lờ đờ có dấu hiệu ngoài đặc trưng của bệnh AHPND cấy ria trực tiếp trên môi trường TCBS hoặc Chromagar kiểm tra lại sự hiện diện của V. parahaemolyticusgây AHPND bằng phương pháp PCR. Ngoài ra, các mẫu tôm lờ đờ ở các nghiệm thức được cố định trong dung dịch Davidson chuyển về phòng thí nghiệm phân tích mô bệnh học.
Thống kê số tôm chết và số tôm sống trong mỗi nghiệm thức để đánh giá LD50 theo công thức:
𝐿𝐷50 = 10(𝑎−𝑃𝐷) 𝑣à 𝑃𝐷 = 𝑃𝑎 − 50 𝑃𝑎 − 𝑃𝑢
Trong đó: 10a là nồng độ tại đó tôm thí nghiệm chết trên 50% PD: khoảng cách tỷ lệ
Pa: tỷ lệ tôm chết cộng dồn cận trên của tỷ lệ tôm chết cộng dồn trung bình là 50%
Pu: Tỷ lệ tôm chết cộng dồn cận dưới của tỷ lệ tôm chết cộng dồn trung bình 50%
2.2.2. Phương pháp thử nghiệm sử dụng probiotic hiệu quả
2.2.2.1. Phương pháp tăng sinh các chủng vi sinh trong chế phẩm sinh học Bacillus B1, S5 và Streptomyces X285
Chế phẩm Bacillus B1 và Bacillus S5 có mật độ Bacillus ban đầu khoảng 2x109 CFU/g; chế phẩm Streptomyces X285 mật độ ban đầu 108 CFU/mL trước khi sử dụng được hoạt hóa và tăng sinh theo công thức sau: bột đậu nành (2g/L), mật rỉ đường (7g/L), cao nấm men (0,5 g/L), chế phẩm Bacillussử dụng trong ao (1g/m3), chế phẩm Streptomyces X285 (1g/m3).
Hai nhóm vi sinh này được nhân sinh khối từng mẻ trong đó sản phẩm
Bacillus được tăng sinh thời gian 18-24 giờ; nhóm Streptomyces được tăng sinh thời gian 60-72 giờ sục khí liên tục trước khixử lý nước định kỳ trong các thí nghiệm.
Với công thức môi trường nhân sinh khối từ sản phẩm trên thì thu được dịch vi sinh vật có lợi tương ứng Bacillus (B1, S5) 109 CFU/mL và Streptomyces X285 là 107 - 108 CFU/mL.
2.2.2.2. Thí nghiệm thăm dò liều sử dụng chế phẩm hiệu quả bằng phương pháp cho ăn và phương pháp xử lý nước
Mục tiêu của nghiên cứu nhằm đánh giá phương pháp cho ăn hay xử lý nước mang lại hiệu quả trong phòng bệnh gan tụy cấp trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng.
Tôm sú/ tôm thẻ (tôm) được bố trí thí nghiệm trong các bể composite thể tích 50 lít chứa 30 lít nước biển sạch độ mặn 20 ‰. Tôm khỏe (2-3 gram) được thuần tại trại giống Vũng Tàu sau đó đưa về phòng thí nghiệm nuôi trong bể sục khí liên tục.
cho ăn probiotic như Bảng 2.2 liên tục trong 14 ngày trước khi gây nhiễm với V. parahaemolyticus đối với phương pháp cho ăn. Phương pháp xử lý nước thì các nghiệm thức thí nghiệm được xử lý 2 lần/ tuần trước khi gây nhiễm. Các nghiệm thức được lặp lại 03 lần và các bể được theo dõi liên tục 10 ngày sau khi gây nhiễm.
Chuẩn bị vi khuẩn V. parahaemolyticustương tự mục 2.2.1
Vi sinh trước khi sử dụng được lên men theo công thức trongmục 2.2.2.1
Bảng 2.2. Thí nghiệm sử dụng chế phẩm probiotic bằng phương pháp cho ăn và phương pháp xử lý nước
Phương pháp sử
dụng probiotic Nghiệm thức Mật độ vi khuẩn
Thời gian sử dụng
Cho ăn
BacillusB1 10
7 CFU/g thức ăn 3 lần/ngày 108 CFU/g thức ăn 3lần/ngày
BacillusS5 10
7 CFU/g thức ăn 3 lần/ngày 108 CFU/g thức ăn 3 lần/ngày
Streptomyces X285 10
7 CFU/g thức ăn 3 lần/ngày 108 CFU/g thức ăn 3 lần/ngày
Đối chứng (ĐC) - 3 lần/ ngày
Xử lý nước BacillusB1 105 CFU/mL 2 lần/tuần
BacillusS5 105 CFU/mL 2 lần/tuần
Streptomyces X285 104 CFU/mL 2 lần/tuần Bac B1-Strep X (B1-X285) 105-104 CFU/mL 2 lần/tuần Bac S5- StrepX (S5-X285) 105-104 CFU/mL 2 lần/tuần Đối chứng - -
Ghi chú: nghiệm thức đối chứng: tôm được cho ăn thức ăn và nuôi trong điều kiện không sử dụng chế phẩm vi sinh
Tôm cảm nhiễm sẽ được ghi nhận tỷ lệ chết hằng ngày và liên tục trong 10 ngày đến khi không còn hiện tượng chết.
Sau đó đánh giá tỷ lệ bảo hộ (relative percent survival – RPS) dựa theo công thức của Amend (1981):
RPS % = 1 − (A/B) x 100% Trong đó:
A:là phần trăm tôm chết ở nhóm phối trộn thức ăn và gây nhiễm V. parahaemolyticus.
B: là phần trăm tôm chết ở nhóm đối chứng V. parahaemolyticus.
2.2.2.3. Phương pháp khảo sát tần suất sử dụng chế phẩm probiotic trong điều kiện phòng thí nghiệm
Mục tiêu: đánh giá thời gian xử lý nước hiệu quả nhằm kiểm soát được V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND
Tôm thẻ, tôm sú khỏe trọng lượng 1,5-2 g/con được bố trí vào các bể nhựa (composite) tròn (500 lít) chứa 350 lít nước biển (độ măn 15-20 ‰) có sục khí liên tục. Mỗi nghiệm thức bố trí 100 tôm/bể cho ăn 3 lần/ ngày, được lặp lại 3 lần. Định kỳ xử lý vi sinh và duy trì mật độ Bacillus tương ứng 105 CFU/mL và Streptomyces
X285 104 CFU/mLtrong các nghiệm thức xừ lý vi sinh theo Bảng 2.3. Các nghiệm thức sau khi xử lý probiotic một ngày theo bố trí Bảng 2.2, tiến hành gây cảm nhiễm V. parahaemolyticus bằng phương pháp ngâm với mật độ 106 CFU/mL. Phương pháp chuẩn bị vi khuản V. parahaemolyticus gây nhiễm và phương pháp lên men các sản phẩm probiotic được miêu tả mục 2.2.2 và 2.2.2.1.
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm tần suất sử dụng probiotic
Nghiệm thức Chủng vi khuẩn sử dụng xử lý nước Tần suất sử dụng NT1 (B-S-X-1) Bacillus(B1,S5)+ Streptomyces X285 1 tuần/ lần NT2 (B-S-X-2) 2 lần/ tuần NT3 (B-S-X-3) 3 lần/ tuần
NT4 (B-S-1) Bacillus B1+ Bacillus S5 1 tuần/ lần
NT5 (B-S-2) 2 lần/ tuần
NT7 (B-X-1) Bacillus B1+ Streptomyces X285 1 tuần/ lần NT8 (B-X-2) 2 lần/ tuần NT9 (B-X-3) 3 lần/ tuần NT10 (S-X-1) Bacillus S5 + Streptomyces X285 1 tuần/ lần NT11 (S-X-2) 2 lần/ tuần NT12 (S-X-3) 3 lần/ tuần Đối chứng dương (ĐC)
2.2.2.4. Thử nghiệm hiệu quả sử dụng probiotic trong mô hình ao nuôi tôm
Dựa vào kết quả thử nghiệm hiệu quả xử lý nước ao nuôi 2 lần/tuần kết hợp giữa các chủng vi sinh vật có lợi (probiotic) trong phòng AHPND trong phòng thí nghiệm xây dựng dự thảo quy trình sử dụng probiotic nhằm ứng dụng quy mô ao nuôi pilot diện tích 600 - 800 m2 tại Trung tâm tập huấn và chuyển giao công nghệ nông nghiệp vùng đồng bằng sông Cửu Long, ấp Nopoul, xã Vĩnh Tân, thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng.
Ao nuôi thẻ được thiết kế phủbạt toàn bộ ao và ao sú chỉ phủ bạt bờ. Hệ thống cấp và thoát nước riêng biệt, hệ thống thu gom chất thải được bố trí giữa ao nhằm định kỳ đưa lượng thức ăn dư thừa và chất thải ra khỏi hệ thống nuôi. Ngoài ra, hệ thống sục khí và quạt được thiết kế nhằm đảm bảo duy trì đủ lượng oxy cho tôm và thu gom chất thải tại các vị trí hố chứa thải trước khi siphon.
Mật độ thả nuôi: 100-120 tôm thẻ/m2 và 30-35 tôm sú/ m2. Tôm postlarvae (PL12) được kiểm tra không mang mầm bệnh như đốm trắng WSSV, đầu vàng (YHD), bệnh còi (MBV), bệnh AHPND, và các mầm bệnh khác trước khi thả.
Số lượng ao thử nghiệm cho đối tượng:
Tôm sú: 2 ao dùng sản phẩm probiotic từ đề tài và 1 ao đối chứng (sản phẩm thương mại).
Tôm thẻ chân trắng: 2 ao dùng sản phẩm probiotic từ đề tài và 2 ao đối chứng (sản phẩm thương mại).
Định kỳ xử lý vi sinh sau khi lên men trong bể nhựa 1m3 tại ao và duy trì mật độ tương ứng Bacillus 105 CFU/mL và Streptomyces X285 104 CFU/mL trong các ao thử nghiệm. Chi tiết bố trí thí nghiệm được thể hiện Bảng 2.4 và 2.5
Bảng 2.4. Bố trí thử nghiệm hiệu quả sử dụng probiotic mô hình ao nuôi tôm thẻ thương phẩm Ao thí nghiệm Chủng vi sinh sử dụng Tần suất sử dụng Liều và cách sử dụng chế phẩm vi sinh Ao 1 (TN1) Hỗn hợp Bacillus (B1, S5) và Streptomyces X285
2 lần/ tuần Lên men sản phẩm trước khi xử lý ao trên bể nhựa (1 m3). Liều dùng 1g sản phẩm/m3 nước ao nuôi Ao 2 (TN2) Ao 3 (ĐC1) Sử dụng chế phẩm vi
sinh thương mại
(Bacillus sp. Rhodobacter sp.) 2 lần/tuần Ao 4 (ĐC2) Sử dụng chế phẩm vi
sinh thương mại
(Bacillus sp.)
1 lần/5 ngày Xử lý trực tiếp sản phẩm liều 0,5-1 g/m3 nước ao nuôi
Ghi chú: Công thức lên men theo mục 2.2.2.1.
Bảng 2.5. Bố trí thử nghiệm hiệu quả sử dụng probiotic mô hình ao nuôi tôm sú thương phẩm Ao thí nghiệm Chủng vi sinh sử dụng Tần suất sử dụng Liều và cách sử dụng chế phẩm vi sinh Kết cấu ao Ao 5 (TN3) Hỗn hợp Bacillus (B1, S5) và Streptomyces X285
2 lần/ tuần Lên men sản phẩm trước khi xử lý ao trên bể nhựa (1 m3). Liều dùng 1g sản phẩm/m3 nước ao nuôi Ao đất Ao 6 (TN4) Ao 7 (ĐC3) Sử dụng chế phẩm vi
sinh thương mại
(Bacillus sp.
Rhodobacter sp.)
Trong quá trình nuôi theo dõi mật độ Vibrio tổng số và V. parahaemolyticus
mẫu nước định kỳ 7 ngày/1 lần. Bên cạnh đó, gen độc PirB của V. parahaemolyticus trong nước ao nuôi được xác địnhbằng phương sinh học phân tửsau khi mẫu nước này được làm giàu trong môi trường dinh dưỡng NB[55].
2.2.2.5. Phương pháp theo dõi và thu mẫu từ ao nuôi
Ao được theo dõi và ghi chép hàng ngày vào sổ nhật ký về lượng thức ăn, xử lý nước, các biểu hiện bất thường tại ao nuôi, theo dõi hàng ngày chỉ tiêu pH, nhiệt độ, độ mặn. Các yếu tố môi trường được kiểm tra hàng tuần gồm nitrite, tổng đạm amon (NH3/NH4+), COD.
2.2.2.6. Phương pháp thu mẫu
Thu mẫu nước: Mẫu nước được thu cách mặt nước 0,5 – 1 m, thu lúc quạt nước ngừngnhằm đảm bảo tính đồng đều của mẫu thu, thu 2 lít nước bảo quản lạnh 4oC và chuyển về phòng thí nghiệm.
2.2.2.7. Phương pháp phân tích mẫu nước
Đối với chỉ tiêu pH,nhiệt độ, độ mặn được kiểm tra tại hiện trường bằng các máy thực địa cầm tay. Các chỉ tiêu còn lạiđược phân tích tại phòng thí nghiệm theo các phương pháp phân tích tiêu chuẩn như Bảng 2.6.
Bảng 2.6. Phương pháp phân tíchmôi trường
STT Thông số Phương pháp phân tích
1 Nhiệt độ Thiết bị chuyên dùng/ đo tại hiện
trường 2 pH 3 Độ mặn 4 N-NO2 SMEWW 4500 NO2- : 2012 5 NH4+/NH3 SMEWW 4500 NH3 F: 2013 6 COD TCVN 6186:1996
2.2.2.8. Phương pháp xác định Vibrio tổng số và V. paraharmolyticus
Tổng số Vibrio trong mẫu nước ao nuôi được xác định bằng phương pháp trải đĩa trên thạch TCBS. Trước hết pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý vô trùng để được dãy nồng độ pha loãng mẫu ở 100, 10-1. Lấy 100 µl mẫu từ các nồng độ này
cấy trên đĩa thạch TCBS (mỗi nồng độ cấy 3 đĩa). Ủ đĩa thạch ở 28-30oC/24h rồi đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch.
Xác định sự hiện diện của V. parahaemolyticus bằng cách cấy mẫu trên môi trường chọn CHROMagarTM Vibrio. V. parahaemolyticus được quan sát trên loại môi trường này khi chúng tạo khuẩn lạc màu tím hoa cà đặc trưng với kích thước 1,5-2 mm sau 24 giờ ủ ở nhiệt độ 28-300C.
2.2.3. Phương pháp phân tích số liệu
Số liệu được tổng hợp bằng Excel và sử dụng phần mềm SPSS (version 16.0) và hàm One-way ANOVA để so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức thí nghiệmtại mức 5% khác biệt với phép thử Turkey.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hiệu quả ức chế AHPND trên tôm sú và tôm thẻ bằng chế phẩm probiotic trong điều kiện phòng thí nghiệm
3.1.1. Đánh giá khả năng gây độc và gây bệnh hoại tử gan tụy của vi khuẩn
V. parahaemolyticus
Kết quả gây cảm nhiễm xác định LD50 của vi khuẩn V. parahaemolyticus được trình bày qua Bảng 3.1, Bảng 3.2, Hình 3.1 và Hình 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả xác định liều LD50 của vi khuẩn V. parahaemolyticus
ở tôm thẻ Nồng độ VK (VP1) Tôm chết (TB) Tôm sống (TB) Tôm chết cộng dồn Tôm sống cộng dồn Tỷ lệ tôm chết % 103 3 12 3 22,5 11,76 104 6,5 8,5 9,5 10,5 47,5 105 13,5 1,5 23 2 92 106 14,5 0,5 37,5 0,5 98,68 PD 0,94 LD50% 11,2 x 103
Hình 3.1. Tỷ lệ chết cộng dồn của tôm thẻ trong thí nghiệm xác định liều LD50
của vi khuẩn V. parahaemolyticus
0 20 40 60 80 100 120 N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 Tỷ lệ chế t cộ ng dồ n % 10^3 10^4 10^5 10^6
Từ Bảng 3.1, Hình 3.1 có một số nhật xét sau:
Mật độ vi khuẩn V. parahaemolyticus đạt 105 CFU/ mL, 106 CFU/ mL có thể gây chết trên 80% số lượng tôm thí nghiệm sau 3 ngày ngâm công cường độc vi khuẩn, với giá trị LD50 của các chủng này biến thiên trong giới hạn hẹp từ 104 đến 105CFU/ mL. Vi khuẩn V. parahaemolyticus thì có giá trị LD50 khoảng 104 CFU/ mL.
Ở các nồng độ khác nhau tỷ lệ chết của tôm thí nghiệm khác nhau, tỷ lệ chết tỷ lệ thuận với nồng độ vi khuẩn gây cảm nhiễm.
Tỷ lệ chết cộng dồn giảm dần theo chiều giảm nồng độ vi khuẩn gây cảm nhiễm, tỷ lệ chết cộng dồn của tôm thí nghiệm biến thiên từ 98,68% ứng với nồng