- Phạm vi nghiên cứu: Công tác nghiên cứu thu thập mẫu được tiến hành tại Vường Quốc gia Xuân Sơn, Vườn Quốc gia Tam Đảo, Trạm ĐDSH Mê Linh. Sau đó, xử lý và phân tích mẫu vật tại Phòng thí nghiệm môi trường thuộc Khoa Môi trường, Trường Đại học Tài nguyên và Môi trường Hà Nội và Khoa Sinh, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội để phân phân lập và nghiên cứu khả năng kháng khuẩn.
- Thời gian nghiên cứu: Quá trình thu mẫu được chia thành 6 đợt, thực hiện bắt đầu từ ngày 02/04/2018 – 10/9/2018.
2.3. Thiết bị nghiên cứu
Dụng cụ thu mẫu ngoài thực địa:
- Găng tay y tế;
- Dao nhỏ: dùng khi đào, lấy mẫu;
- Giấy bút ghi chép mô tả nhanh ngoài hiện trường, út đánh dấu mẫu, sổ ghi chép;
- Máy định vị GPS hoặc điện thoại di động có chức năng định vị; - Máy ảnh kỹ thuật số (hoặc điện thoại có camera sắc nét);
- Kính lúp;
- Dao lam, chổi nhỏ (vệ sinh đất bám trên mẫu);
Dụng cụ, thiết bị trong phòng thí nghiệm
- Kính hiển vi, lamen kính, lá kính; - Dao lam, nhíp;
- H2O, dầu soi kính, KOH 10% ; - Isopropanol;
- Đĩa petri 10cm;
- Bình nuôi cấy mô, bình tam giác, pipep, cốc đong,...; - Máy đo pH; - Lò sây, lò hấp; - Tủ cấy; - Tủ ấm vi sinh; - Máy lắc; - Máy li tâm;
- Găng tay, khẩu trang;
- Bút, giấy dán nhãn, sổ ghi chép, máy ảnh.
2.4. Môi trƣờng nghiên cứu
- Môi trường giữ giống: sử dụng môi trường PDA (Potato Dextro Agar) với thành phần (g/L) như sau: 1000ml dịch chiết khoai tây, 20gr glucose, 20gr agar;pH = 5.6 ± 0.2. Môi trường được điều chỉnh pH bằng NaCl (1M) và HCl NaCl (1M).
- Môi trường nuôi cấy hệ sợi nấm: Môi trường PDB (Potato Dextro Broth) được sử dụng trong nuôi cấy sợi nấm thu dịch nuôi cấy thô. Thành phần môi trường tương tự môi trường PDA nhưng không ổ sung agar.
- Môi trường giữ giống vi khuẩn kiểm định và thử hoạt tính kháng khuẩn: Môi trường MPA (Meat pepton agar) được sử dụng với thành phần (g/L) như sau: 1000ml H2O, 5gr cao thịt, 5gr pepton, 5gr Nacl, 20gr thạch; pH = 7-7,2. Môi trường MPB (Meat Pepton Broth) là môi trường có thành phần tương tự môi trường MPA nhưng không ổ sung agar.
Các môi trường sau khi pha chế theo thành phần như trên, trước khi sử dụng đều được khử trùng ở điều kiện 121C, tương đương 1atm, trong thời gian 15-20 phút.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp thu mẫu và bảo quản
a. Phƣơng pháp thu mẫu
- Vị trí lấy mẫu: Mẫu nấm được lấy ngẫu nhiên tại các độ cao khác nhau, những khu vực có cây lâu năm, dưới gốc cây, trên thân cây, thân gỗ mục và chủ yếu dọc theo các trục đường di chuyển chính trong rừng tại khu vực nghiên cứu.
- Thời gian thích hợp lấy mẫu: Các mẫu nấm được tiến hành lấy vào các tháng 4, 5, 6, 7, 8 đây là khoảng thời gian nấm sinh sản và phát triển mạnh, và nên lấy các mẫu nấm sau mưa khoảng 2-3 ngày vì thời tiết mưa xong nấm sẽ phát triển rất nhanh.
- Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ lấy mẫu.
- Khi phát hiện mẫu nấm lấy máy ảnh chụp ảnh toàn bộ cây nấm (gồm mũ nấm, lỗ nấm, cuống nấm) và sinh cảnh khu vực có mẫu nấm. Chụp cùng thước kẻ để có thể đo nhanh kích thước của nấm.
- Quan sát và ghi chép nhanh các đặc điểm bên ngoài của nấm là: màu sắc, mặt mũ nấm, mặt lỗ nấm và các phần phụ (có vảy, lông, có nhầy dính, biến màu…), môi trường sống xung quanh nấm, các đặc điểm tự nhiên, sinh cảnh tại khu vực lấy mẫu. Có thể ghi nhanh tên mẫu nếu biết tên của mẫu nấm.
- Tiếp đến, tiến hành thu mẫu: Để thu mẫu ở trên gỗ phải dùng dao nhọn hay rìu để tách nấm ra khỏi giá thể. Khi tách cần lấy cả một phần nhỏ mẫu gỗ mà nấm sống trên đó và chú ý quan sát xem nấm có tạo nên thể hình rễ, hạch nấm dưới vỏ hay trong gỗ không. Nếu nấm mọc trên đất thì cần lấy cả rễ và loại bỏ bớt đất đi. Không lấy những mẫu bị hư hỏng.
- Mẫu được cho vào giấy bạc gói cẩn thận tránh để mẫu bị dập nát hoặc bào tử lẫn lộn vào nhau trong quá trình đưa về phòng thí nghiệm, sau đó cho vào hộp nhựa đậy kín nắp, tiến hành dán nhãn, đánh số cho mẫu.
Lưu ý:
+ Khi thu mẫu phải thu thập hết số mẫu không nên bỏ sót mẫu khi thu thập, thu mẫu với tất cả các kích thước, cả còn non lẫn trưởng thành, nếu mẫu là loài phổ biến với số lượng lớn, cần thu với lượng thích hợp.
+ Những mẫu nấm có kích thước nhỏ, dễ gãy vỡ được đựng riêng trong các lọ nhỏ, hộp nhựa...
+ Không lấy mẫu nấm Linh chi có kích thước dưới 2cm.
+ Không dùng túi nilon để đựng mẫu vì nó không thoát khí và hơi nước, tạo điều kiện thuận lợi cho mốc và vi khuẩn phát triển và dễ làm gãy, nát mẫu.
+ Những mẫu đã quá già hoặc bị côn trùng phá hoại, không được thu thập lẫn vào mẫu khác để tránh lây lan, phá hỏng các mẫu nấm khác.
+ Trường hợp mẫu là loại hiếm và không còn mẫu nào khác, có thể thu và để riêng sau đó xử lý đặc biệt trong phòng thí nghiệm.
b. Khảo sát đa dạng sinh học nấm
Theo Lê Thanh Huyền (2015), các quy trình cơ ản tiến hành điều tra nấm ngoài thực địa theo các chuẩn quốc tế được nêu ra theo mẫu đính kèm ở phụ lục 1. Các mẫu nấm thu được trong nghiên cứu này được phân tích một số đặc điểm tại thực địa dựa theo mẫu này [8].
c. Xử lý mẫu
Các mẫu nấm mới thu thập chưa kịp phân tích cần được bảo quản ở nơi thoáng mát, trong tủ lạnh 4°C không quá một ngày hay phơi khô. Sau khi mẫu được phân tích, sấy khô bằng máy sấy hoa quả ở nhiệt độ trong khoảng 40 – 45oC. Khi mẫu khô được chuyển sang bảo quản lâu dài trong túi bóng dán kín miệng túi cùng gói hút ẩm và dán nhãn đầy đủ phía ngoài túi bảo quản mẫu (ghi rõ tên khoa học, người thu mẫu, vị trí, mọc gần hay trên những cây thực vật nào, ngày thu mẫu và ký hiệu số mẫu).
2.5.2. Phương pháp thu thập tài liệu
Các tài liệu liên quan đến đối tượng nghiên cứu được thu thập và kế thừa bao gồm:
- Bản đồ vị trí địa lý VQG Tam Đảo, VQG Xuân Sơn, trạm ĐDSH Mê Linh;
- Bản đồ địa hình;
- Các tài liệu nghiên cứu về VQG Tam Đảo, VQG Xuân Sơn, trạm ĐDSH Mê Linh;
- Các tài liệu nghiên cứu về nấm lớn trước đó ở các khu vực nghiên cứu khác ở Việt Nam và các nghiên cứu trên thế giới;
- Các tài liệu nghiên cứu liên quan tới chi nấm Ganoderma ở Việt Nam và trên thế giới.
2.5.3. Phương pháp phân tích
a. Phân tích hình thái bên ngoài
Hình thái bên ngoài của loài nấm lớn khi c n tươi được mô tả dựa trên hình thái quả thể mũ nấm, màu sắc của mũ, lá và cuống nấm, kích thước (chiều cao của nấm, chiều rộng mũ nấm), đặc điểm chi tiết của thân, mũ và lá, số seri của lá nấm, mùi vị và nhựa (nếu có). Đặc điểm của quả thể khi còn non, trưởng thành và già (nếu có) được ghi nhận. Nhựa nấm chảy ra từ quả thể (nếu có) được thu lại bằng giấy trắng hoặc khăn giấy trắng và ghi lại chính xác màu sắc của nhựa.
Màu sắc: là một trong những yếu tố rất quan trọng trong việc định loại
loài, vì vậy việc ghi lại nhanh màu sắc của nấm khi vẫn ở trên giá thể là việc hết sức cần thiết vìmàu sắc của nấm thay đổi rất nhanh sau khi thu và bảo quản trong hộp. Bên cạnh đó, quá trình thay đổi của mũ nấm có màu sắc của v ng đồng tâm và các đặc điểm trong điều kiện rừng khô thì có thể một số quả thể có mũ nấm màu nhạt hơn và thay đổi màu sắc. Một số loài nấm có thể thay đổi màu khi quả thể bị cắt làm đôi và đặc điểm này cũng cần được ghi chú lại. Tất cả màu sắc của mũ (pileus), lá (lamella), cuống (stipe) đều được ghi lại từ quả thể non đến quả thể già và đến khi quả thể khô lại [8].
Lƣu ý: Màu sắc của nấm phải được mô tả dưới điều kiện ánh sáng ban ngày và theo sách hướng dẫn sắc độ màu của Kornerup và Wanscher [36].
Đặc điểm bề mặt: Mũ và cuống nấm có thể xù xì hoặc nhẵn bóng hoặc
nhăn, có rãnh hay khía, khô, dày hoặc mỏng, v ng đồng tâm (zone), ... Tất cả những đặc điểm trên đều phải được quan sát và ghi lại rõ ràng và cụ thể [8]. Phiến nấm đính và cấu trúc: Phiến nấm ngắn hay dài tới cuống nấm hay
gọi là phiến nấm đính tự do hay cố định. Đây cũng là một trong những đặc điểm giúp phân loại loài. Ngoài ra, phiến nấm có nhánh (số seri >1) hay không có nhánh (số seri = 1) được tìm thấy ở rất nhiều loài khác nhau [8].
Nếm và ngửi: Mỗi một loài nấm có mùi vị đặc trưng riêng, có nhiều loài
có mùi mạnh, thường có vị cay hay vị dịu, đắng, chát hoặc chỉ hơi cay cay. Ở nhiều loài nấm có mùi tanh và một số loài có mùi vị dịu hoặc thơm [8].
b. Phân tích các dẫn liệu hiển vi
Kỹ thuật soi kính hiển vi:
- Nhỏ 3 giọt nước cất nhỏ lên lam kính, sau đó xắt 3 mẩu nhỏ mẫu ở lá, mũ và cuống nấm cấy lần lượt lên mỗi giọt nước, lấy dao lam dầm nát mẫu nấm, tiếp tuc lấy lamen kính đậy lên, ấn nhẹ để làm nát mẫu lần nữa.
- Quan sát tiêu bản mẫu ở vật kính x4, x10 và x40. Tiếp đó, nhỏ 1 giọt dầu soi kính (Immersion oil) lên tiêu bản để soi mẫu ở vật kính x100.
Lƣu ý: Khi soi kính với dầu ở vật kính x100, chỉ được phép quay lại quan sát ở vật kính (x4) và (x100).
Những dẫn liệu hiển vi cần xác định:
- Bào tử (tại lá nấm): Kích thước, hình dạng, màu sắc, cấu trúc (thành dày hay mỏng, có giọt nội chất hay không, nội chất có màu hay không màu, giữa hai lớp có tầng cột chống hay không);
- Đảm - Basidia (tại lá nấm): Kích thước, hình dạng, có bao nhiêu sừng, màu sắc, cấu trúc (thành dày hay mỏng, nội chất bắt màu hay không bắt màu);
- Cystidia (tại lá nấm): Kích thước, hình dạng, xuất hiện nhiều hay ít, màu sắc, cấu trúc (thành dày hay mỏng, nội chất bắt màu hay không bắt màu); - Cấu trúc hệ sợi Pellis (Pileipellis (tại mũ nấm); Stipitipellis (tại thân nấm)): Kích thước, hình dạng, phân nhánh hay không phân nhánh, không có vách ngăn hay có vách ngăn, cấu trúc sợi (thành dày hay mỏng, nội chất bắt màu hay không), kiểu mối kẹp liên kết (Clamp connection).
2.5.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
Để thu dịch chiết, các mẫu quả thể được sấy ở 40°C trong 72 giờ, sau đó lấy 1gr nghiền ra thành bột. Bột nghiền thô được ngâm trong bình tam giác dung tích 100ml chứa ethyl acetate 0,1N theo tỷ lệ 1:4 (w/v) trong 10 ngày ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng được lắc. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc loại bỏ bã nghiền và để ay hơi tự nhiên trong tủ hút mùi ở nhiệt độ phòng, thu dịch chiết thô cô đặc.
Sau khi thuần được hệ sợi trong môi trường thạch PDA, tiếp tục cấy nấm sang 50mL môi trường PDB trong bình tam giác và nuôi lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 30°C để thu dịch nuôi cấy thô và xác định khả năng kháng khuẩn. Tại thời điểm sau 7, 14 ngày nuôi cấy, ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút thu dịch nổi.
Hệ sợi được thu nhận bằng lọc dịch nuôi cấy qua giấy lọc Whatman, sấy ở nhiệt độ 40°C cho đến khối lượng không đổi. Hệ sợi thu được bổ sung 40mL ethyl acetate 0,1N để trong thời gian 72 giờ ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc mẫu. Thu nhận dịch chiết thô bằng cách để ay hơi dung môi tự nhiên trong tủ hút mùi ở nhiệt độ ph ng cho đến khi dịch chiết còn khoảng 2mL. Lặp lại quá trình chiết rút này 2 lần.
Đánh giá khả năng kháng khuẩn:
- Nguyên tắc: nếu dịch nuôi cấy nấm có hoạt tính kháng VSV kiểm định thì chúng sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định và hình thành vòng tròn vô khuẩn.
- Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch đĩa:
Bước 1: Dùng pipet vô trùng lấy 0,1mL môi trường lỏng có chứa VSV kiểm định nhỏ vào đĩa Petri có chứa môi trường MPA đặc. Mỗi chủng VSV kiểm định được cấy riêng rẽ trên một hộp lồng.
Bước 2: Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt dịch chứa VSV kiểm định trên bề mặt môi trường thạch cho đến khi bề mặt môi trường khô.
Bước 3: Hút lấy 100μL dịch nuôi cấy nấm hoặc dịch chiết hệ sợi được chuẩn bị như trên nhỏ lên miếng giấy lọc tròn, vô trùng (đường kính 6mm), để khô tự nhiên trong tủ cấy.
Bước 4: Dùng panh vô trùng gắp mảnh giấy lọc đã được tẩm dịch nuôi cấy nấm đặt lên trên bề mặt môi trường thạch trong các hộp Petri đã nuôi cấy các vi sinh vật kiểm định.
Bước 5: Các hộp Petri được để trong tủ mát ở 4°C với thời gian 6-8h, sau đó được chuyển ra tủ ấm 30°C. Sau 24-48h, tiến hành kiểm tra khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định của các chủng nấm nghiên cứu bằng cách xác định đường kính của vòng kháng khuẩn xuất hiện xung quanh các giếng thạch.
Thí nghiệm trên mỗi chủng nấm trên được lặp lại 3 lần đối với mỗi loại vi khuẩn kiểm định.
Đối chứng: 100μL môi trường PDB không nuôi cấy nấm nhỏ lên miếng giấy thấm vô trùng, tr n (D = 6mm) (đối chứng dương) và 100μL nước cất vô trùng nhỏ lên miếng giấy thấm vô trùng tr n (D = 6mm) (đối chứng âm).
2.5.5. Phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
Sinh khối tươi thu được từ dịch nuôi lắc hệ sợi được lọc qua giấy lọc Whatman. Dùng panh gắp cả miếng giấy lọc có chứa hệ sợi đặt vào đĩa petri, sấy ở nhiệt độ 40°C trong tủ sấy cho đến khối lượng không đổi. Tất cả đều được tiến hành trong môi trường và dụng cụ vô trùng.
2.5.6. Phương pháp thu dịch nổi
Dịch chiết nấm sau khi được nuôi lắc trong tủ 7 ngày ở điều kiện yêu cầu được hút 1,5ml cho vào ống eppendorf 2ml, đặt vào máy ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút.
Thu dịch nổi ở phía trên, không hút phần sinh khối.
2.5.7. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân loại các mẫu nghiên cứu
Qua 6 đợt thu mẫu, tôi đã thu được 39 mẫu nấm Ganoderma. Sau quá trình phân loại sơ ộ và tách cấy hệ sợi, chọn ra được 6 mẫu để phân loại và nghiên cứu (TL44, TL48, TL53, TL.TĐ 18.01, TL.TĐH, TL.TĐ 02).
Với các mẫu nghiên cứu, tôi tiến hành mô tả hình thái ên ngoài và hình thái hiển vi của 6 mẫu thuần này, để từ đó phân loại loài phục vụ cho công tác nghiên cứu chính xác hơn.
a.Ganoderma aff. brownii
(Nguồn gốc ảnh của tác giả)
Hình 3.1: Mẫu nấm TL 44
(Thước đo = 50 mm) Đặc điểm hình thái ên ngoài của các mẫu như sau:
Mẫu TL 44: có kích thước 320mm x 450mm, ề mặt trên của phiến nấm có màu nâu nhạt dần từ cuống ra ngoài mép nấm, viền có màu nâu đen, có các
trắng đục và chuyển dần sang màu nâu xám khi chạm vào. Nấm có mùi hắc nhẹ (Hình 3.1 và 3.2). Mẫu được lấy tại VQG Xuân Sơn, vị trí tọa độ 21o8’17” B – 104o56’34” Đ, độ cao 270m so với mực nước iển.
So sánh với đặc điểm của Ganoderma brownii (Murrill) Gil ertson: Quả thể một năm hay nhiều năm, không cuống, lie gỗ, mũ hình quạt hay già án cầu, kích thước 8-10(52)x11-13x2-3 cm, ề mặt trên màu nâu đen nhẵn, có