Để thu dịch chiết, các mẫu quả thể được sấy ở 40°C trong 72 giờ, sau đó lấy 1gr nghiền ra thành bột. Bột nghiền thô được ngâm trong bình tam giác dung tích 100ml chứa ethyl acetate 0,1N theo tỷ lệ 1:4 (w/v) trong 10 ngày ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng được lắc. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc loại bỏ bã nghiền và để ay hơi tự nhiên trong tủ hút mùi ở nhiệt độ phòng, thu dịch chiết thô cô đặc.
Sau khi thuần được hệ sợi trong môi trường thạch PDA, tiếp tục cấy nấm sang 50mL môi trường PDB trong bình tam giác và nuôi lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ 30°C để thu dịch nuôi cấy thô và xác định khả năng kháng khuẩn. Tại thời điểm sau 7, 14 ngày nuôi cấy, ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút thu dịch nổi.
Hệ sợi được thu nhận bằng lọc dịch nuôi cấy qua giấy lọc Whatman, sấy ở nhiệt độ 40°C cho đến khối lượng không đổi. Hệ sợi thu được bổ sung 40mL ethyl acetate 0,1N để trong thời gian 72 giờ ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc mẫu. Thu nhận dịch chiết thô bằng cách để ay hơi dung môi tự nhiên trong tủ hút mùi ở nhiệt độ ph ng cho đến khi dịch chiết còn khoảng 2mL. Lặp lại quá trình chiết rút này 2 lần.
Đánh giá khả năng kháng khuẩn:
- Nguyên tắc: nếu dịch nuôi cấy nấm có hoạt tính kháng VSV kiểm định thì chúng sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định và hình thành vòng tròn vô khuẩn.
- Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch đĩa:
Bước 1: Dùng pipet vô trùng lấy 0,1mL môi trường lỏng có chứa VSV kiểm định nhỏ vào đĩa Petri có chứa môi trường MPA đặc. Mỗi chủng VSV kiểm định được cấy riêng rẽ trên một hộp lồng.
Bước 2: Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt dịch chứa VSV kiểm định trên bề mặt môi trường thạch cho đến khi bề mặt môi trường khô.
Bước 3: Hút lấy 100μL dịch nuôi cấy nấm hoặc dịch chiết hệ sợi được chuẩn bị như trên nhỏ lên miếng giấy lọc tròn, vô trùng (đường kính 6mm), để khô tự nhiên trong tủ cấy.
Bước 4: Dùng panh vô trùng gắp mảnh giấy lọc đã được tẩm dịch nuôi cấy nấm đặt lên trên bề mặt môi trường thạch trong các hộp Petri đã nuôi cấy các vi sinh vật kiểm định.
Bước 5: Các hộp Petri được để trong tủ mát ở 4°C với thời gian 6-8h, sau đó được chuyển ra tủ ấm 30°C. Sau 24-48h, tiến hành kiểm tra khả năng kháng các vi sinh vật kiểm định của các chủng nấm nghiên cứu bằng cách xác định đường kính của vòng kháng khuẩn xuất hiện xung quanh các giếng thạch.
Thí nghiệm trên mỗi chủng nấm trên được lặp lại 3 lần đối với mỗi loại vi khuẩn kiểm định.
Đối chứng: 100μL môi trường PDB không nuôi cấy nấm nhỏ lên miếng giấy thấm vô trùng, tr n (D = 6mm) (đối chứng dương) và 100μL nước cất vô trùng nhỏ lên miếng giấy thấm vô trùng tr n (D = 6mm) (đối chứng âm).