Cân 5 (mg) mẫu trong một lọ thủy tinh có nút vặn dung tích 5mL, thêm vào 2 mL HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, trong thời gian 6 giờ. Lấy 10 μL dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 μL TCA (Trichlorua acetic axít ) và 100μL hỗn hợp (0,5% gelatin + 0,5% BaCl2) lắc đều rồi đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ= 360 nm. Hàm lƣợng sulfate đƣợc tính dựa vào đƣờng chuẩn dựng từ dung dịch K2SO4 với khoảng nồng độ từ 0,25-1 μg/mL [85].
2.3.5. Phân tích hàm lƣợng uronic axit
Cân 5 (mg) bột fucoidan thô hòa tan vào H2O cất thành 1mL. Lấy 250 μL dung dịch mẫu (mẫu fucoidan và mẫu so sánh (mẫu carbohydrate không chứa uronic axit)) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 mL dung dịch A (0,9 g NaBH4 hòa tan trong 10 mL nƣớc cất, thêm vào từ từ 90 mL dung dịch axít sulfuric 98% đã đƣợc làm lạnh), phản ứng đƣợc tiến hành ở 100oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nƣớc đá, thêm tiếp 50 μL dung dịch B (100 mg Carbazole đƣợc hòa tan trong 100 mL cồn tuyệt đối) lắc đều và cho phản ứng lại ở 100oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo quang ở bƣớc sóng λ = 525 nm. Sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [86].
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU
Kể từ khi fucoidan đƣợc phân lập và nghiên cứu lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 cho đến ngày nay, đã có rất nhiều các quy trình chiết tách fucoidan khác nhau đƣợc công bố ứng dụng trong nghiên cấu trúc hóa học cũng nhƣ trong sản xuất ở qui mô công nghiệp. Mỗi một phƣơng pháp đều có những ƣu điểm và nhƣợc điểm riêng. Tùy vào mục đích khác nhau mà ta có thể chọn phƣơng pháp khác nhau để phục vụ cho tách chiết có hàm lƣợng cao, chi phí giảm, không gây ô nhiễm môi trƣờng, hay tách chiết để nghiên cứu cấu trúc làm sao tránh ảnh hƣởng tối đa đến cấu trúc tự nhiên của fucoidan.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát chiết fucoidan trong ba dung môi khác nhau: trung tính (H2O), axit (dung dịch HCl 0,01N), dung dịch muối CaCl2 2%, đánh giá mức độ ảnh hƣởng của dung môi chiết lên sự biến đổi một số thành phần hóa học cơ bản của fucoidan . Kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lƣợng thu nhận fucoidan chiết trong các dung môi khác nhau
Các kết quả Dung môi chiết
thu nhận
H2O HCl 0,01N CaCl2 2%
Khối lƣợng rong khô đã 500 500 500
chiết(g)
Khối lƣợng fuoidan thô 11,50 9,00 7,200
thu đƣợc(g) Hàm lƣợng thu nhận(%) 2,30 1,80 1,44 Hàm lƣợng carbohydrate 27,780 32,130 35,820 tổng(%)(**) Hàmlƣợng sulfate 16,880 22,300 22,800 (%)(**) Hàm lƣợng uronic 23,750 20,900 14,260 axit(%)(**)
** Hàm lƣợng tính theo khối lƣợng mẫu fucoidan
Fucoidan thô đã đƣợc chiết tách thu nhận từ rong nâu Sargassum
oligocystum trong ba dung môi H2O, axít HCl 0,01N, CaCl2 2% với hàm lƣợng thu nhận lần lƣợt 2,30%, 1,80% và 1,44% so với trọng lƣợng rong khô đã đƣợc xử lý loại bỏ các hợp chất màu và lipid. Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lƣợng fucoidan thô đối với mỗi dung môi chiết khác nhau sẽ khác nhau. Hàm lƣợng thu nhận fucoidan cao nhất khi chiết trong môi trƣờng trung tính (H2O) và thấp nhất khi chiết với dung dịch muối CaCl2 2%. Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về hàm lƣợng thu nhận fucoidan là do mỗi dung môi khác nhau sẽ có độ phân cực, moment lƣỡng cực, hệ số phân cực và liên kết hidro khác nhau dẫn đến quá trình phá vỡ vách tế bào để trích li chất cần chiết vào trong dung môi của rong nâu khác nhau. Mặt khác, khi tiến hành chiết với dung môi CaCl2 2%, CaCl2 đã kết tủa với các muối alginate hóa trị (I) ở trong tế bào rong nâu về dạng muối canxi alginate
không tan, do đó chúng cố định trên bã rong và thuận lợi trong quá trình loại bỏ bằng cách lọc. Bên cạnh đó, CaCl2 còn liên kết với các hợp chất polyphenol hình thành phức không tan và cố định trên bã rong, do đó sản phẩm fucoidan thô thu nhận đƣợc khi chiết bằng phƣơng pháp này cũng tinh khiết hơn.
Ngoài sự khác nhau về hàm lƣợng thu nhận fucoidan thô, thành phần hóa học các mẫu fucoidan này cũng có sự khác nhau. Theo kết quả phân tích bảng 3.1, mẫu fucoidan đƣợc chiết bằng CaCl2 2% có hàm lƣợng sulfate 22,80% có cao hơn một ít so với mẫu fucoidan đƣợc chiết bằng axit loãng 22,03%, nhƣng sự khác biệt này là không đáng kể. Mặt khác, hàm lƣợng uronic axit của mẫu fucoidan chiết bằng axit loãng cao hơn rất nhiều so với mẫu fucoidan chiết bằng CaCl2 2%. Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trƣớc đây cho thấy sulfate và uronic axit là hai trong những yếu tố có ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính sinh học của fucoidan. Và do mục đích thu nhận sản phẩm để nghiên cứu đặc trƣng cấu trúc nên mẫu fucoidan đƣợc chiết trong dung dịch axit loãng ở nhiệt độ 60oC đƣợc chúng tôi lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Phƣơng pháp chiết fucoidan bằng dung môi axit loãng cũng là phƣơng pháp đƣợc lựa chọn trong nhiều nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan đã đƣợc công bố.
So với các kết quả về hàm lƣợng fucoidan đã đƣợc công bố trƣớc đó của các loài rong S.swartzii, S.oligocystum, S.denticapum, S.mcclurei,
S.polycystum, Turbinaria ornata [18,46,69] lần lƣợt là 2,88 %, 3,92 %, 3,74
%, 3,56 %, 2,94 %, 4,22 % có thể thấy hàm lƣợng fucoidan trong cùng một chi rong cũng khác nhau, theo các nhà nghiên cứu trƣớc đây sự khác nhau về hàm lƣợng fucoidan trong các loài rong này có thể đƣợc giải thích là do sự khác nhau về thời gian thu rong, vị trí địa lý và phƣơng pháp chiết. So với các loài rong nâu thuộc chi Sargassum của các nƣớc khác trên thế giới nhƣ Mexico, Brazil, Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc,… hàm lƣợng fucoidan của rong nâu Việt Nam cao hơn so với loài rong Sargassum stenophyllum (Brazil) 0,4% [88] và các loài rong Sargassum ringgoldianum 0,13 % [89],
Hizikia fusiformis 1,30 % [91] của Nhật Bản và thấp hơn các loài rong, Sargassum myriocystum 5,34 %, Sargassum wightii 6,72% (Ấn Độ) [92], Sargassum horneri 4,3 % (Mexico) [93].
Bảng 3.2. Hàm lƣợng fucoidan thu nhận từ 08 loài rong nâu Việt Nam
Stt Loài rong Hàm lƣợng Tài liệu
fucoidan tham khảo
% 1 S.swartzii 0,82 [68] 2 S.oligocystum 1,8 3 S.denticapum 2,00 [46] 4 S.mcclurei 2,37 [46] 5 S.polycystum 2,57 [46] 6 S.binderi 1,13 [46] 7 T.ornata 1,23 [46] 8 Padina 1,93 [46] australis
Tóm lại, sự khác biệt về hàm lƣợng fucoidan trong các loài rong rất khó để đƣa ra so sánh, bởi hàm lƣợng fucoidan thu đƣợc nhìn chung thay đổi rất nhiều (0,1-20%) phụ thuộc vào điều kiện địa lý, quá trình sinh trƣởng và phát triển, cũng nhƣ phƣơng pháp chiết tách để thu nhận fucoidan.
Chất lƣợng sản phẩm fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum thu nhận đƣợc theo quy trình chiết tách fucoidan thuộc bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657) [83] để nghiên cứu cấu trúc đƣợc đánh giá qua đƣờng cong phân bố KLPT của các polysaccharide xác định bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC (Gel Permeation Chromatography).
Khối lƣợng phân tử (D)
Hình 3.1. Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum Sắc ký đồ GPC của hai fucoidan này trên hình 3.1 chỉ cho một peak với chỉ số đa phân tán PI = Mw/Mn = 3,88 cho thấy mức độ phân tán về khối lƣợng phân tử của các polysaccharide là không lớn và không lẫn với các thành phần khác.
Kết quả khảo sát trên cho thấy phƣơng pháp phân lập fucoidan từ rong nâu thuộc bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657) cho hàm lƣợng chiết tách tƣơng đối cao, khối lƣợng phân tử phân bố tập trung, độ phân tán không nhiều và hoàn toàn thích hợp để áp dụng trong nghiên cứu các đối tƣợng rong nâu ở vùng biển Việt Nam.
3.2. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN
Theo những nghiên cứu của các nhà khoa học trƣớc đây cùng với những công trình khoa học đã đƣợc công bố trên thế giới và ở Việt Nam, cấu trúc phân tử fucoidan chiết từ các loài rong có chứa thành phần các gốc đƣờng fucose, galactose, mannose, xylose, glucose có thể giống nhau hoặc không giống nhau và tỉ lệ này khác nhau ở mỗi loài, điều này giúp ta có thể dự đoán về bộ khung monosaccharide các hợp chất fucoidan cấu trúc rất phức tạp và độ lặp lại không cao. Cấu trúc của fucoidan có thể khác nhau giữa các loài rong nâu khác nhau và có thể thay đổi khác nhau ngay trong
cùng một loài. Do sự không đồng nhất cấu trúc của fucoidan trong các loài rong nâu, các điều kiện tách chiết khác nhau, làm gia tăng đáng kể các fucoidan. Có thể cơ bản chia làm hai nhóm, một nhóm fucoidan từ Laminaria
saccharina, L. digitata, Analipus japonicus, Cladosiphon okamuranus, và Chorda filum có mạch chính đƣợc tạo thành bởi liên kết lặp lại đều đặn của
các gốc (1→3)-α-L-fucopyranose, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 hoặc vị trí C-4. Nhóm thứ hai bao gồm fucoidan từ các lòai rong Fucus và
Ascophyllum nodosum có liên kết chính lặp lại một cách tuần tự các gốc
(1→3)-α-L-Fucopyranose và (1→4)-α-L-Fucopyranose. Do sự phức tạp trong thành phần cũng nhƣ cấu trúc, nên việc xác định các đặc trƣng cấu trúc của fucoidan là hết sức khó khăn. Phân đoạn tinh chế fucoidan là một bƣớc quan trọng làm đơn giản hóa việc phân tích các đặc trƣng cấu của chúng. Fucoidan thô (0,5g) đƣợc hòa tan trong 5mL dung dịch HCl 0,04N, ly tâm tách phần tủa không tan là axít polyuronic (PA), phần dịch trong đƣa lên cột DEAE- cellulose (3,2x32 cm) với trung tâm hoạt động là nhóm amin mang điện tích dƣơng (+1). Đầu tiên rửa cột với dung dịch HCl 0,04N đến khi thử âm tính với cacbonhydrate bằng phƣơng pháp phenol-axit sulfuric[84], tiếp theo rửa cột với dung dịch NaCl gradient nồng độ từ 0-2N, các phân đoạn fucoidan thu đƣợc theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl đƣợc thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thƣớc 10kDa trong nƣớc cất với thời gian 48h, sau đó đem đông khô để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột.
Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2x32 cm) (hình 2.1) đƣợc chỉ ra trên hình 3.2
F1
Hình 3.2. Phân đoạn fucoidan đƣợc chiết từ rong S.oligocystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose
Bảng 3.3. Hàm lƣợng thu nhận các phân đoạn fucoidan Kí hiệu mẫu Khối lƣợng mẫu Hàm lƣợng Công thức tính
thu nhận thu nhận(%) F1 16,5(mg) 3,30 (16,5x100):500 F2 22,4(mg) 4,48 (22,4x100):500 F3 8,15(mg) 1,63 (8,15x100): 500 F4 140(mg) 28,00 (140x100):500 F5 127,5(mg) 25,50 (127,5x100):500
Kết quả tách phân đoạn fucoidan từ rong S. oligocystum (hình 3.2) ta thấy có 05 phân đoạn F1, F2, F3, F4 và F5 đƣợc tách ra với các nồng độ rửa giải khác nhau của muối NaCl lần lƣợt là 0,5N; 0,8N; 1,0N; 1,2N và 1,5N. Với 05 phân đoạn thu đƣợc sau khi tách sắc ký cho thấy khả năng rong nâu
S.oligocystum sinh tổng hợp nên 5 loại fucoidan khác nhau. So với kết quả phân đoạn thu đƣợc của fucoidan từ các loài rong khác thuộc chi Sagassum có thể thấy mỗi loài rong khác nhau sẽ tổng hợp lên các loại fucoidan với nhiều dạng cấu trúc khác nhau. Các phân đoạn fucoidan đƣợc tách ra bằng sắc ký trao đổi anion chủ yếu phụ thuộc vào mật độ nhóm mang điện tích
(nhóm sulfate). Điều này có thể đƣợc giải thích là do hàm lƣợng sulfate càng lớn thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh, vì vậy để giải phóng phân đoạn fucoidan này cần dung dịch rửa giải có nồng độ muối cao hơn. Chính vì lý do này mà các phân đoạn fucoidan từ mỗi loài rong khác nhau sẽ đƣợc rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl khác nhau. Hàm lƣợng và thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan rong S. oligocystum đƣợc trình bày trong bảng 3.2. Kết quả cho thấy hàm lƣợng của các phân đoạn fucoidan F1-F5 dao động từ 1,63 -28,00%, trong đó cao nhất là phân đoạn F4 (28,00 %) và thấp nhất là phân đoạn F3 (1,63 %). Vì các phân đoạn F1, F2, F3 hàm lƣợng thu đƣợc rất thấp nên chúng tôi không tiến hành phân tích thành phần hóa học của phân đoạn này. Hai phân đoạn F4 và F5 có hàm lƣợng cao nhất đƣợc lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và các đặc điểm cấu trúc.
Phân tích xác định thành phần của các monosaccharide là việc quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharide nói chung và của fucoidan nói riêng. Fucoidan là một polymer dị thể có thành phần hóa học phức tạp, ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, chúng còn chứa các đƣờng đơn khác nhƣ galactose, mannose, xylose, glucose,... và uronic axit. Vì vậy, để xác định thành phần hóa học của fucoidan chúng tôi tiến hành thủy phân fucoidan thành các monomer trong môi trƣờng axít. Việc thủy phân hoàn toàn để xác định thành phần các đƣờng đơn của fucoidan trên thực tế rất khó xảy ra, do đó chúng tôi tiến hành xác định tỉ lệ mol giữa các gốc đƣờng đã đƣợc thủy phân và dựa vào tổng carbohydrate để tính thành phần của mỗi đƣờng đơn trong mẫu fucoidan. Sắc ký đồ của các mẫu đƣờng chuẩn đƣợc trình bày trên hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đƣờng đơn chuẩn
Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đƣờng đơn phân đoạn F4
Kết quả phân tích thành phần monosaccharide, hàm lƣợng sulfate và uronic axít của mẫu fucoidan thô đƣợc trình bày trên bảng 3.4.
Bảng 3.4. Thành phần hóa học mẫu fucoidan chiết từ rong S.oligocystum Kí hiệu mẫu Thành phần đƣờng đơn của Cacbo 2- Uronic
SO4
fucoidan (mol %)
hydrate % axit
Fuc Gal Xyl Man Gluc % w/w** %
w/w** w/w** PS- 53,40 23,70 11,40 11,50 nd 32,130 22,300 20,900 S.oligocystum PS- 42,30 38,30 7,10 8,90 3,40 Chƣa 22,460 21,540 S.oligocystum khảo sát (Tác giả Phạm Đức Thịnh)
** Hàm lƣợng tính theo khối lƣợng của fucoidan;
Các kết quả phân tích trong bảng 3.4 cho thấy hàm lƣợng sulfate và uronic axit của mẫu fucoidan đƣợc chiết tách từ rong S.oligocystum tƣơng ứng là 22,300 % và 20,900 %, kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trƣớc đó đã đƣợc công bố cho loài rong này của tác giả Phạm Đức Thịnh [46]. Kết quả này cho thấy hàm lƣợng uronic axit của polysacharide sunfate từ loài rong này cao hơn nhiều so với hàm lƣợng uronic axit của polysacharide sunfate từ các loài rong nâu nói chung và rong nâu thuộc cùng chi rong Sargassum nói riêng đã nghiên cứu trƣớc đây, điều này có thể đƣợc lý giải là do polysaccharide từ mỗi loài rong khác nhau thƣờng có sự khác biệt về thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc.
Kết quả bảng 3.4 cho thấy mẫu fucoidan đƣợc thu nhận từ rong nâu
Sargassum oligocystum trƣớc khi chạy sắc kí phân đoạn ngoài hai thành phần
chính là fucose (53,40%) và galactose (23,70%) còn có thêm các đƣờng đơn khác với hàm lƣợng nhỏ hơn là mannose (11,50%), xylose (11,40%), không
chứa glucose. So với kết quả đã đƣợc công bố về fucoidan của loài rong này, Phạm Đức Thịnh và cộng sự đã thu nhận đƣợc trong mẫu fucoidan có chứa các gốc đƣờng fucose (42,30%) và galactose (38,30%), mannose (8,90%), xylose (7,10%) và đặc biệt có chứa thêm một lƣợng nhỏ glucose (3,40%). Nhƣ vậy, chúng ta có thể nhận thấy, tỉ lệ giữa các gốc đƣờng trong cùng một loài rong nhƣng ở những thời điểm nghiên cứu khác nhau là không giống nhau và đặc biệt theo nhóm tác giả này, thành phần đƣờng của các phân đoạn của fucoidan rong S. oligocystum có chứa gốc đƣờng glucose, trong khi đó, thành phần đƣờng đơn từ mẫu fucoidan của cùng loài rong này, tôi không nhận thấy sự có mặt của gốc đƣờng glucose. Nhƣ vậy, hàm lƣợng các gốc đƣờng này biến đổi theo từng chi rong và từng loài rong khác nhau. Các kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trƣớc đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của fucoidan. Kết quả phân tích thành phần đƣờng chỉ ra rằng fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau, các loài rong thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đƣờng đơn. Những đặc điểm