2.2.1.2 .Ph ơng pháp phân oạn fucoidan
2.2.2.3. Ph ơng pháp xácịnh hà ml ợng sulfate
Hàm lƣợng sulfate đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp đo độ đục với BaCl2/gelatine, sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [85].
2.2.2.4. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng uronic axit
Hàm lƣợng uronic axít đƣợc xác định sử dụng phƣơng pháp Carbazole, sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [86].
2.2.2.5. Sắc ký thẩm thấu gel (GPC)
Khối lƣợng phân tử trung bình của fucoidan xác định bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC). GPC là một kỹ thuật sắc ký để phân tách các phân tử kích thƣớc lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột. GPC có thể xác định một vài thơng số cấu trúc quan trọng bao gồm trọng lƣợng trung bình Mw, trọng lƣợng phân tử trung bình số Mn, và đặc trƣng cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố trọng lƣợng phân tử của nó. GPC đƣợc sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn nhƣ polymer tổng hợp hay các polymer tự nhiên nhƣ polysaccharide. Ngồi việc cung cấp thơng tin về sự phân bố trọng lƣợng phân tử, GPC cũng tách một hợp chất phân tử lớn phức tạp thành các thành phần của nó nhƣ polymer, oligomer, monomer và các chất phụ gia [87].
Tác giả Descamps và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel đƣợc áp dụng để tinh chế và phân đoạn fucoidan theo trọng lƣợng phân tử. Áp dụng sắc ký thẩm thấu gel sau khi thực hiện sắc ký trao đổi ion là phƣơng
pháp đặc trƣng để loại bỏ muối đƣợc sử dụng để giải hấp chất quan tâm khỏi nhựa trao đổi ion. Mặc dù, thẩm tách và kết tủa trong cồn cũng đƣợc sử dụng cho mục đích loại muối và các hợp chất trọng lƣợng phân tử thấp. Tuy nhiên, sắc ký thẩm thấu gel là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này cho phép phân đoạn fucoidan theo trọng lƣợng phân tử, đồng thời loại bỏ đƣợc muối cũng nhƣ các tạp chất trọng lƣợng phân tử thấp khác. Các loại nhựa đƣợc sử dụng cho việc tinh chế và phân đoạn polysaccharide là Sephadex G-50 và G-100, Sepharose CL-6B, CL-48 và Sephacryl S-400 [87]. Sắc ký thẩm thấu gel và sắc ký trao đổi anion khơng gây ảnh hƣởng lên nhóm este sulfate của polysaccharide. Tuy nhiên, sự thay đổi mạnh về lực ion có thể ảnh hƣởng đến cấu hình khơng gian của các polysaccharide. Những sự thay đổi về cấu hình phân tử này có thể cũng ảnh hƣởng đến hoạt tính sinh học của chúng.
Phép đo GPC đƣợc thực hiện trên thiết bị HPLC Agilent 1100, với cột Shodex SB-806HQ và detector RID (refractive index detector) tại Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Nhiệt độ của cột đƣợc giữ ở 60oC. Fucoidan nồng độ 1mg/mL. Thể tích mẫu bơm là 0,5mL với tốc độ 1,0mL/phút. Dung dịch NaCl (1mg/mL) đƣợc sử dụng làm chất rửa giải [87].
2.2.2.6. Ph ơng pháp phổ hồng ngoại IR
Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trƣng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại mà ta có thể xác định đƣợc vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đƣờng ở vị trí axial hay equatorial (bảng 2.1). Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, cịn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào phổ NMR để xác định các vị trí này.
Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trƣng của fucoidan trên phổ hồng ngoại
Đỉnh Dao động
775 Dao động dãn vòng của - anome
802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6
822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí equatorial
845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial
847 Dao động của liên kết C1-H của - anome 893 Dao động của liên kết C1-H của anomer 917 Dao động vịng của -anome
1030-1167 Dao động hố trị của hemiacetal 1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C 1255-1264 Dao động hoá trị của S=O
1420 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-O 1430 Dao dộng gấp của C-H
1730 Dao động hoá trị của C=O 3300-3440 Dao động hoá trị của O-H
Phổ hồng ngoại FT-IR của fucoidan đƣợc ghi trên máy Carl Zeiss IR-75 spectrometer (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dƣơng - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đơng, L.B.Nga), trong vùng số sóng 4000-400 cm-1. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1 ta có thể xác định đƣợc các nhóm sulfate trong các phân tử đƣờng nằm ở vị trí axial hay equatorial.
2.2.2.7. Ph ơng pháp phổ cộng h ởng từ hạt nhân NMR
Trong phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton, tất cả proton của carbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysaccharide-) có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng từ 1-6 ppm. Các proton anomeric của mỗi monosaccharide có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β- của chúng. Ví dụ, hầu hết các proton của α - anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6 ppm, trong khi đó các proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton đƣợc coi nhƣ một phƣơng pháp đặc trƣng để nhận biết fucoidan dựa vào nhóm methyl ở vị trí C6 với tín hiệu
từ 1,2 đến 1,4 ppm là vùng là vùng đặc trƣng H-6 của nhóm methyl, các tín
hiệu có độ dịch chuyển hóa học từ 5,0 đến 5,5ppm là vùng của H-1 (H- α) của fucoidan.
Hình 2.3. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysaccharide Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhƣng lại có nhiều thuận lợi hơn phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc của polysaccharide do
các tín hiệu trong phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ 1H- NMR. Vì vùng giá trị lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhau nhƣ trong phổ proton NMR. Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ
13C-NMR thƣờng xuất hiện trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các tín hiệu của C-nonanomeric xuất hiện trong vùng từ 60-85 ppm. Với fucoidan thì vùng tín hiệu đặc trƣng để nhận biết trong phổ 13C-NMR là vùng trƣờng cao từ 15-20 ppm thuộc về nhóm methyl (C-6) của vịng α-L-fucopyranose. Các tín hiệu của cacbon α-anomeric thƣờng xuất hiện trong vùng từ 95-103 ppm, trong khi cacbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng từ 101-105 ppm. Với nguyên tử cacbon carboxyl của axít uronic các tín hiệu sẽ xuất hiện ở vùng trƣờng thấp hơn từ 170-180 ppm. Các tín hiệu của ngun tử cacbon có gắn với nhóm -OH, nhƣ C-6 của vòng pyranose và C-5 của vòng furanose xuất hiện trong vùng trƣờng cao hơn từ 60-64 ppm, trong khi các tín hiệu của các nguyên tử cacbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng furanose) xuất hiện trong vùng 65-87 ppm.
Nhƣ vậy, có thể thấy việc đánh giá và phân tích cấu trúc của các polysaccharide là rất khó khăn và với polysaccharide sulfate hóa từ rong biển cịn khó khăn hơn rất nhiều do chúng có cấu trúc rất phức tạp, có mạch nhánh và chuỗi liên kết có mức độ lặp lại khơng cao nên việc phân tích cấu trúc chỉ dựa vào phổ 1H-NMR và 13C-NMR là khơng đủ. Để đánh giá phân tích cấu trúc các polysaccharide phức tạp này các nhà khoa học thƣờng kết hợp phƣơng pháp hóa học nhƣ chiết phân đoạn hoặc tách phân đoạn dựa vào sắc ký trao đổi ion, sau đó làm đơn giản hóa cấu trúc bằng các phản ứng đề sulfate hóa, metyl hóa, đề acetyl hóa, tiếp theo kết hợp các phƣơng pháp phổ NMR, đôi khi cả phƣơng pháp khối phổ (MS) để phân tích cấu trúc.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR đƣợc ghi trên máy Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dƣơng - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đơng, L.B.Nga và Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Mẫu fucoidan đƣợc pha trong D2O với nồng độ 20
μg/mL, đo ở tần số 75.5 MHz tại nhiệt độ 35oC.
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu
* Chiết tách fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum trong dung môi HCl 0,01N
Các mẫu rong đƣợc cắt nhỏ (2-3 cm), xử lý loại màu và các phân đoạn trọng lƣợng phân tử thấp với hỗn hợp (96% EtOH : Cloroform : H2O = 89 : 1 :10) theo tỉ lệ w/v= 1/10 trong thời gian 10-15 ngày, hỗn hợp đƣợc lọc tách, rong đƣợc phơi khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phòng.
Mẫu rong sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu (500 g) đƣợc tiến hành chiết 3 lần với 15 lít dung dịch HCl 0,01N (pH 2-3) ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 2h với mỗi lần chiết. Dịch chiết đƣợc lọc tách thô qua vải lọc, dịch chiết chứa các polysaccharide tan trong nƣớc của 3 lần chiết đƣợc gộp lại và trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 8% đến pH = 6-7. Dịch chiết sau trung hòa đƣợc loại bớt nƣớc bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 50-60oC. Sau đó, chúng tơi lại tiến hành cơ đặc và làm sạch dịch chiết bằng màng thẩm tách kích thƣớc 10kDa để thẩm tách loại muối, các hợp chất màu và các tạp chất trọng lƣợng phân tử thấp trong thời gian kéo dài (48 giờ). Dịch chiết sau khi đƣợc làm sạch và cơ đặc tới 1/10 thể tích ban đầu và đƣợc kết tủa bằng EtOH 98% theo tỉ lệ thể tích Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đơng khơ bằng cách sử dụng máy đông khô chân không ta thu đƣợc bột polysaccharide dạng thô chứa fucoidan.
* Chiết tách fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum trong dung môi CaCl2 2%
Chiết tách fucoidan trong dung môi CaCl2 2% thực hiện dựa trên nền tảng phƣơng pháp của Bilan và cộng sự. Rong nâu Sargassum oligocystum đƣợc xử lý ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp Me-OH – CHCl3 – H2O theo tỉ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu, lọc rửa với aceton, sấy khô. Sau khi sấy khô rong nâu đƣợc chiết với dung môi CaCl2 2% ở 85oC trong 3 giờ (chiết lặp lại
3 lần). Dịch chiết đƣợc gộp lại, sau đó đem cơ quay chân khơng đến cịn 1/4 thể tích ban đầu. Dịch sau cô quay sẽ thêm từ từ hexadecyltrimethylammo- niumbrommide nồng độ 10% trong nƣớc vào để kết tủa polysaccharide sulfate (fucoidan). Kết tủa tạo thành đƣợc ly tâm, rửa với nƣớc cất nhiều lần để loại bỏ cetavlon dƣ. Kết tủa sau đó đƣợc hịa tan bằng cách khuấy trộn với dung mơi NaCl bão hịa trong cồn 20% ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-3 ngày, khi kết tủa đƣợc hòa tan hết bổ sung thêm 3 lần thể tích cồn 98% để kết tủa fucoidan. Rửa kết tủa với cồn 75% vài lần và sau đó hịa tan lại trong nƣớc cất. Dung môi đƣợc thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô thu đƣợc fucoidan (polysaccharide sulfate) thô dƣới dạng muối Natri.
* Chiết tách fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum trong dung mơi n ớc
Quy trình chiết fucoidan bằng nƣớc đƣợc thực hiện dựa trên nền tảng của Percival và Ross từ rong Fucus vesiculosus năm 1950 [22]. Chiết với nƣớc sôi trong 24 giờ. Sau đó loại bỏ alginate và protein bằng Pb-acetate. Fucoidan đƣợc kết tủa bằng Ba(OH)2, tủa dƣới dạng tạo phức với hydroxide, sau đó đem phức đi thủy phân trong H2SO4 loãng. Cuối cùng fucoidan đƣợc tách ra là làm sạch bằng màn thẩm tách trong thời gian kéo dài.
*Phân oạn tinh chế fucoidan bằng sắc ký trao ổi anion
Cân 0,5g bột polysaccharide thô gồm (fucoidan, laminaran và polyuronan) hòa tan trong dung dịch HCl 0,04N, ly tâm tách phần tủa không tan ta loại đƣợc polyuronan (PA) dƣới dạng kết tủa axít polyuronic, phần dịch trong đƣa lên cột DEAE-Cellulose (dạng Cl-, 3,0 x 32 cm). Đầu tiên rửa cột với dung dịch HCl 0,04N đến khi thử âm tính với hydrate cacbon bằng phƣơng pháp phenol-axít sulfuric ta thu đƣợc phân đoạn laminaran, tiếp theo rửa giải cột bằng muối NaCl theo gradient tuyến tính liên tục nồng độ tăng dần từ 0-2N, các phân đoạn fucoidan (F1, F2, F3, F4, F5) đƣợc tách ra theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl, mỗi phân đoạn thu
đƣợc cho thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thƣớc 10kDa trong nƣớc cất sau thời gian 24h, sau đó đem đơng khơ để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột [83].
2.3.2. Phân tích hàm lƣợng tổng carbohydrate
Cân 5 (mg) bột fucoidan thơ hịa tan vào H2O cất thành 1mL. Lấy 200 µL dung dịch cần xác định có hàm lƣợng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/mL, thêm vào 200µL thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt, thêm tiếp 1mL axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ = 490 nm. Sử dụng D-glucose làm chất chuẩn [84].
2.3.3. Phân tích thành phần monosaccharide
Phân tích thành phần các đƣờng đơn của fucoidan là bƣớc quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Quy trình chung để xác định các đƣờng đơn là thủy phân fucoidan thành các monosaccharide và sau đó phân tích thành phần của từng monosaccharide bằng phƣơng pháp sắc ký. Hai phƣơng pháp sắc ký phổ biến nhất đƣợc sử dụng để phân tích thành phần các đƣờng đơn là phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân tích gián tiếp thơng qua các dẫn xuất acetyl hóa của chúng bằng sắc ký khí (GC): Fucoidan đƣợc thủy phân → Khử → Acetyl hóa → Sắc ký [84].
Mẫu fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn dung tích 5mL, thêm 1mL TFA (Triflorua acetic axít) 2M lắc đều cho tan, đem thủy phân ở 100oC trong 6 giờ sau đó cho bay hơi đến gần khơ bằng máy cơ quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dƣ. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 mL nƣớc đề ion, dung dịch này đƣợc dùng để phân tích thành phần đƣờng trên thiết bị phân tích carbohydrate IC-500 Biotronik (Germany), sử dụng cột Shim-pack ISA- 07/S2504 (0.4 x 25 cm), pha động là đệm Borat kali, tốc độ rửa giải 0,6 mL/phút. Đƣờng đơn đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C-R2 AX. Các đƣờng đơn fucose, glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose đƣợc sử dụng làm chất
chuẩn. Hàm lƣợng các đƣờng đơn đƣợc tính theo % mol dựa vào các chất chuẩn.
2.3.4. Phân tích hàm lƣợng sulfate
Cân 5 (mg) mẫu trong một lọ thủy tinh có nút vặn dung tích 5mL, thêm vào 2 mL HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, trong thời gian 6 giờ. Lấy 10 μL dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 μL TCA (Trichlorua acetic axít ) và 100μL hỗn hợp (0,5% gelatin + 0,5% BaCl2) lắc đều rồi đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ= 360 nm. Hàm lƣợng sulfate đƣợc tính dựa vào đƣờng chuẩn dựng từ dung dịch K2SO4 với khoảng nồng độ từ 0,25-1 μg/mL [85].
2.3.5. Phân tích hàm lƣợng uronic axit
Cân 5 (mg) bột fucoidan thơ hịa tan vào H2O cất thành 1mL. Lấy 250 μL dung dịch mẫu (mẫu fucoidan và mẫu so sánh (mẫu carbohydrate không chứa uronic axit)) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 mL dung dịch A (0,9 g NaBH4 hòa tan trong 10 mL nƣớc cất, thêm vào từ từ 90 mL dung dịch axít sulfuric 98% đã đƣợc làm lạnh), phản ứng đƣợc tiến hành ở 100oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nƣớc đá, thêm tiếp 50 μL dung dịch B (100 mg Carbazole đƣợc hòa tan trong 100 mL cồn tuyệt đối) lắc đều và cho phản ứng lại ở 100oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phịng và tiến hành đo quang ở bƣớc sóng λ = 525 nm. Sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [86].
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU
Kể từ khi fucoidan đƣợc phân lập và nghiên cứu lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 cho đến ngày nay, đã có rất nhiều các quy trình chiết tách fucoidan khác nhau đƣợc công bố ứng dụng trong nghiên cấu trúc hóa học