2.2.1.2 .Ph ơng pháp phân oạn fucoidan
2.2.2.7. Ph ơng pháp phổ cộn gh ởng từ hạt nhân NMR
Trong phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton, tất cả proton của carbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysaccharide-) có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng từ 1-6 ppm. Các proton anomeric của mỗi monosaccharide có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β- của chúng. Ví dụ, hầu hết các proton của α - anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6 ppm, trong khi đó các proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton đƣợc coi nhƣ một phƣơng pháp đặc trƣng để nhận biết fucoidan dựa vào nhóm methyl ở vị trí C6 với tín hiệu
từ 1,2 đến 1,4 ppm là vùng là vùng đặc trƣng H-6 của nhóm methyl, các tín
hiệu có độ dịch chuyển hóa học từ 5,0 đến 5,5ppm là vùng của H-1 (H- α) của fucoidan.
Hình 2.3. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysaccharide Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhƣng lại có nhiều thuận lợi hơn phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc của polysaccharide do
các tín hiệu trong phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ 1H- NMR. Vì vùng giá trị lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhau nhƣ trong phổ proton NMR. Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ
13C-NMR thƣờng xuất hiện trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các tín hiệu của C-nonanomeric xuất hiện trong vùng từ 60-85 ppm. Với fucoidan thì vùng tín hiệu đặc trƣng để nhận biết trong phổ 13C-NMR là vùng trƣờng cao từ 15-20 ppm thuộc về nhóm methyl (C-6) của vịng α-L-fucopyranose. Các tín hiệu của cacbon α-anomeric thƣờng xuất hiện trong vùng từ 95-103 ppm, trong khi cacbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng từ 101-105 ppm. Với nguyên tử cacbon carboxyl của axít uronic các tín hiệu sẽ xuất hiện ở vùng trƣờng thấp hơn từ 170-180 ppm. Các tín hiệu của nguyên tử cacbon có gắn với nhóm -OH, nhƣ C-6 của vòng pyranose và C-5 của vòng furanose xuất hiện trong vùng trƣờng cao hơn từ 60-64 ppm, trong khi các tín hiệu của các nguyên tử cacbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng furanose) xuất hiện trong vùng 65-87 ppm.
Nhƣ vậy, có thể thấy việc đánh giá và phân tích cấu trúc của các polysaccharide là rất khó khăn và với polysaccharide sulfate hóa từ rong biển cịn khó khăn hơn rất nhiều do chúng có cấu trúc rất phức tạp, có mạch nhánh và chuỗi liên kết có mức độ lặp lại khơng cao nên việc phân tích cấu trúc chỉ dựa vào phổ 1H-NMR và 13C-NMR là khơng đủ. Để đánh giá phân tích cấu trúc các polysaccharide phức tạp này các nhà khoa học thƣờng kết hợp phƣơng pháp hóa học nhƣ chiết phân đoạn hoặc tách phân đoạn dựa vào sắc ký trao đổi ion, sau đó làm đơn giản hóa cấu trúc bằng các phản ứng đề sulfate hóa, metyl hóa, đề acetyl hóa, tiếp theo kết hợp các phƣơng pháp phổ NMR, đơi khi cả phƣơng pháp khối phổ (MS) để phân tích cấu trúc.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR đƣợc ghi trên máy Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dƣơng - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đơng, L.B.Nga và Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Mẫu fucoidan đƣợc pha trong D2O với nồng độ 20
μg/mL, đo ở tần số 75.5 MHz tại nhiệt độ 35oC.