CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Fucoidan mới chỉ đƣợc biết đến và nghiên cứu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Năm 2006, lần đầu tiên tại Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã đƣa ra quy trình cơng nghệ chiết xuất và phân lập fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Đây là một quy trình cơng nghệ cao, sử dụng màng siêu lọc cho phép đồng thời cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch fucoidan tại nhiệt độ phòng, nhờ vậy giữ nguyên đƣợc hoạt tính sinh học tự nhiên vốn có của chúng.
Nƣớc ta với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong
nâu Việt Nam vẫn cịn rất hạn chế. Các nghiên cứu cơng bố về fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đƣa ra các đặc điểm về cấu trúc nhƣ thành phần đƣờng, vị trí nhóm sulfate và phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu fucoidan chiết thô. Năm 2008, NCS Nguyễn Duy Nhứt đã công bố thành phần và cấu trúc của phân đoạn fucoidan F20 đƣợc phân lập từ rong Sargassum swartzii với thành phần chủ yếu là fucose (> 45%), bên cạnh đó các đƣờng đơn khác nhƣ rhamnose, mannose và galactose cũng chiếm hàm lƣợng đáng kể (10,81 - 22,07%), tác giả đã đƣa ra trình tự liên kết giữa các gốc đƣờng hexose, uronic axít và fucose, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20 [69].
Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố fucoidan từ rong Turbina
ornata có hàm lƣợng sulfate cao và thành phần đƣờng rất đơn giản chỉ gồm
fucose và galactose theo tỉ lệ 3:1, đây là một dạng galactofucan sulfate hóa. Cấu trúc bộ khung của chúng là các gốc α-L-Fucp liên kết 3, sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4. Nhóm sulfate cũng đƣợc phát hiện thấy chiếm ƣu thế ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4 của gốc galactose trong mạch nhánh đƣợc tạo nên bởi các gốc galactose liên kết 4 [26,80]. Hàm lƣợng fucoidan trong rong Nâu Việt Nam chiếm từ 0,5-2,7 % khối lƣợng khơ và chúng thuộc về nhóm galactofucan sunfate. Các fucoidan chiết từ 05 loài rong
S. polycystum, S. oligocystum, S. swatzii, S. denticarpum và Turbinaria ornata
có hoạt tính chống ung thƣ gan (Hep-2), ung thƣ màng tim (RD) và fucoidan chiết từ rong S.mcclurei có hoạt tính chống ung thƣ vú cả 06 loại fucoidan này đều có hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính chống kháng trực khuẩn mủ xanh là P. Aeruginosa. Trong số fucoidan đem thử hoạt tính thì fucoidan từ rong S.polycystum và Turbinaria ornata có hoạt tính cao nhất. Sử dụng các phƣơng pháp phân tích hóa học, GLC, IR, NMR và ESI-MS nhóm tác giả đã bƣớc đầu đƣa ra đƣợc đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn fucoidan từ loài rong S.polycystum; S.swartzii và Turbina ornata [26,80].
Vị trí nhóm sunfate trong fucoidan chiết từ 03 lồi rong thuộc chi rong
Sargassum và loài rong Turbina ornata nằm ở vị trí C4 của vịng pyranosse
và chỉ một phần H4 bị sulfate hóa. Nhóm sulfate ở vị trí C4 của cả 02 monome: fucose và galactose đối với fucoidan từ rong Turbina ornata. Liên
kết glycoside chính trong mạch là liên kết (1→3) và có thể có mạch nhánh. Tuy nhiên các cấu trúc đƣa ra trên vẫn chỉ là dự đoán và còn một số vấn đề chƣa giải quyết thỏa đáng đó là các dữ liệu phổ về các kiểu liên kết và các chuỗi oligosaccharide trong mạch chính và mạch nhánh của fucoidan.
Năm 2013, các tác giả Bùi Minh Lý, Thành Thị Thanh Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Usov và cộng sự đã tìm ra đƣợc cấu trúc của fucoidan từ
Sargassum polycystum Việt Nam :
Hình 1.9. Cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum
Phạm Đức Thịnh và cộng sự [46] đã chiết tách fucoidan từ 05 loài rong
S. denticapum, S. polycystum, S. swartzii, S. mcclurei và Turbina ornata và
nghiên cứu đặc trƣng cấu trúc của các phân đoạn đại diện cho fucoidan của mỗi lồi rong, thu đƣợc những kết quả chính sau:
- Phân đoạn fucoidan SdF3 từ rong S.denticapum có thành phần là fucose (51,9%), galactose (34,4%), mannose (5,8%) và xylose (8,9%). Hàm
lƣợng sulfate (39,14%). Liên kết đƣờng trong mạch chủ yếu là liên kết 1→3, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4.
- Phân đoạn fucoidan SpF3 từ rong S.polycystum có thành phần là fucose (68,8%), galactose (26,9%) và xylose (4,5%), hàm lƣợng sulfate (33,99%). Liên kết đƣờng trong mạch chủ yếu là liên kết →3)-α-L- Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4.
- Phân đoạn fucoidan SwF5 từ rong S.swartzii có thành phần là fucose (57,1%), galactose (27,4%), mannose (4,0%), xylose (0,9%), rhamnose (2,0%) và glucose (2,0%), hàm lƣợng sulfate (42,3%). Liên kết đƣờng chủ yếu trong mạch là →3)-α-L-Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)- α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2.
- Phân đoạn fucoidan SmF3 từ rong S.mcclurei có thành phần là fucose (58,5%), galactose (41,5%), hàm lƣợng sulfate (35%) . Liên kết đƣờng trong mạch chủ yếu là →3)-α-L-Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)- α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và/hoặc C4.
- Phân đoạn fucoidan ToF2 từ rong Turbina ornata có thành phần là fucose (69,6%), galactose (27,7%) và rhamnose (2,7%), hàm lƣợng sulfate (43,26%). Liên kết đƣờng chủ yếu trong mạch là →3)-α-L- Fucp-(1→ và một phần liên kết →4)-α-L-Fucp-(1→, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2.
- Phân đoạn fucoidan SmF3 từ rong Sargassum mcclurei, cấu trúc của chúng gồm: →3)-Fuc(2,4SO3-)-(1→3)-Fuc(2,4SO3-)-(1→ chèn thêm vào gốc α-L-Fucp(3SO3-) liên kết 4 và gốc galactose liên kết 6 ở đầu cuối khử.
Fuc(2SO3-)-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc(2SO3-)-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc Gal(2SO3-)-(1→3)-Fuc(2SO3-)-(1→4)-Gal-(1→3)-Fuc-(1→3)-Fuc
Lần đầu tiên phát hiện ra sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L- Fucp và gốc →4)-β-D-Gal liên kết luân phiên trong mạch galactofucan từ rong Sargassum
Trong luận án của Hồ Đức Cƣờng [18] fucoidan chiết tách từ rong nâu
Sargassum henslowianum đã đƣợc xác định với thành phần đƣờng chính là
fucose và glucose. Cấu trúc hóa học của fucoidan này có mạch chính tạo thành từ α-(1→3)-L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C-2, C-4 và một phần của C-3 của fucose. Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C-4 và liên kết với mạch chính qua liên kết glycoside (1 - 4). Đây là một fucoidan có cấu trúc mới vì đa số các fucoidan chỉ bị sulfate hóa ở vị trí 1 hoặc 2 của gốc đƣờng fucose, trong khi fucoidan này cả 3 vị trí C-2, C-3 và C-4 đều bị sulafte hóa. Đã xác định fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum swartzii có cấu trúc mạch nhánh và cấu trúc không gian của cả phân tử và ở kích thƣớc cỡ nano đều có dạng hình que. Bằng cách sử dụng cùng các phƣơng pháp hiện đại nhƣ tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của fucoidan đƣợc nghiên cứu . Hồ Đức Cƣờng và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo (lần đầu tiên ở Việt Nam) và in vitro của fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii thể hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu trên các dịng tế bào
ung thƣ thử nghiệm nhƣng khơng thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum
swartzii ở liều 100mg/kgP/ngày đã có tác dụng làm giảm một số chỉ tiêu sinh
hố mỡ máu, khối lƣợng mỡ trên mơ hình chuột béo phì.
Đến năm 2017, Bùi Văn Nguyên và cộng sự đã chiết xuất, phân lập, xác định các thành phần cấu tạo và khối lƣợng phân tử trung bình của các fucoidan từ 06 loài rong nâu của Nha Trang là: S. polycystum (Fsp), S.
mcclurei (Fsm), S. oligocystum (Fso), S. denticarpum (Fsd), S. swatzii (Fss),
Bảng 1.5. Hàm lƣợng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam
Tên loài HS Thành phần đƣờng trung bình Gluc Sulfate M
(ký hiệu mẫu (%) (% mol) A (%) W
fucoidan) Fuc Man Gal Xyl Glc (%) kDa
S. polycystum 2,70 32,4 2,7 36,3 11,1 10,2 6,8 25,7 52 (Fsp) S. mcclurei 2,10 40,0 2,1 33,1 6,2 20,6 5,2 26,5 26 (Fsm) S. 1,60 37,6 1,6 37,0 10,7 7,1 6,5 24,9 38 oligocystum (Fso) S. 2,20 42,1 2,2 38,9 15,9 2,0 5,8 25,2 41 denticarpum (Fsd) S. swatzii 0,68 37,0 0,68 34,8 15,5 6,5 7,4 23,4 41 (Fss) T. ornata 2,75 30,3 vết 9,0 vết vết 7,8 25,6 88 (Fto)
Điểm nổi bật nhất trong luận án của tác giả Bùi Văn Nguyên là đã nghiên cứu và mô tả đƣợc đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ hai loài rong
Sargassum duplicatum và Sargassum binderi. Kết quả cho thấy các fucoidan
từ hai loài rong này là các galactofucan sulfate. Kết quả này một lần nữa góp phần khẳng định đại đa số các fucoidan tách từ các loài rong nâu sinh trƣởng ở vùng nhiệt đới thƣờng gặp dạng galactofucan sulfate.
Các kết quả nghiên cứu phổ IR, NMR (1D và 2D) và ESI-MS/MS chothấy phân đoạn FTD-2,0N từ rong Turbinaria decurrens là một galactofucan tạo thành từ 2 loại đƣờng (1→3)-α-L-Fuc với nhóm thế sulfate tại vị trí C-2 và β -D-galactose mang nhóm sulfate tại vị trí C-6. Galactose nối
với fucose qua liên kết glucoside 1→4. Mảnh cấu trúc cơ bản của FTD-2,0N đƣợc đề xuất nhƣ sau:
[→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3-)-1→]n
Hình 1.10. Mảnh cấu trúc cơ bản fucoidan chiết tách từ rong
Turbinaria decurrens
Bùi Văn Nguyên và cộng sự [81] đã tiến hành nghiên cứu hình dáng và kích thƣớc của các mẫu fucoidan bằng phƣơng pháp tán xạ tia X góc nhỏ. Kết quả phân tích đồ thị Kratky của sự tán xạ tia X góc nhỏ cho thấy các mẫu fucoidan có hình dáng kiểu que (rod-like) với các mạch nhánh cồng kềnh và mức độ phân nhánh khác nhau. Kết quả tính tốn cho các mơ hình lý thuyết cho thấy các mạch nhánh có khả năng nằm kề nhau và có độ dài tới 5 gốc đƣờng.
Ngồi ra, tác giả Bùi Văn Nguyên đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên hai dịng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 và ung thƣ mơ liên kết RD. Kết quả cho thấy các mẫu α đều thể hiện hoạt tính. Hai mẫu có hoạt tính cao nhất là Fto (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 3,1 và 1,6 µg/mL) và Fsp (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 5,5 và 5,7 µg/mL).
Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 và ung thƣ mô liên kết RD
Mẫu Fucoidan Hep-G2 RD
CS% IC50 (µg/mL) CS% IC50 (µg/mL) S. polycystum (Fsp) 29.7 5.5 11.8 5.7 S. mcclurei (Fsm) 39.3 14.2 64.8 > 20 S. oligocystum (Fso) 35.3 15.8 11.2 11.4 S. denticarpum (Fsd) 37.5 7.3 27.9 15.9 S. swatzii (Fss) 31.1 5.8 16.5 18.7 T. ornata (Fto) 21.8 3.1 4.5 1.6
Khảo sát mối liên hệ giữa hoạt tính gây độc tế bào với một số đặc điểm cấu tạo và cấu trúc của các mẫu fucoidan sơ bộ cho thấy:
- Khối lƣợng phân tử trung bình có tƣơng quan rõ rệt nhất với hoạt tính gây độc tế bào. Các mẫu có khối lƣợng phân tử trung bình cao nhất cũng có hoạt tính cao nhất. Các mẫu có khối lƣợng phân tử trung bình thấp nhất cũng có hoạt tính thấp nhất;
- Mức độ sulfate hóa của các đƣờng cũng thể hiện ở một mức độ nhất định tƣơng quan với hoạt tính gây độc tế bào. Tỉ lệ sulfate/đƣờng cao gắn liền với hoạt tính cao và ngƣợc lại;
- Khơng thấy có biểu hiện tƣơng quan rõ rệt giữa mức độ cồng kềnh (độ dài) của các mạch nhánh (thể hiện qua bán kính hồi chuyển của mặt cắt ngang Rgc) với hoạt tính gây độc tế bào. Các dữ kiện trên gợi ý rằng khối lƣợng phân tử cao và cấu trúc phân nhánh với tỉ lệ sulfate/đƣờng cao là các yếu tố cần thiết cho hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan.
Năm 2017, Bilan và cộng sự đã công bố cấu trúc của fucoidan từ
hợp phổ NMR các tác giả này đã xác định đƣợc 03 polysaccharide có cấu trúc khác nhau sau khi khử sunfate deS-2, deS-4, deS-6.
Ngồi ra, nhóm các nhà khoa học này đã sử dụng thêm phƣơng pháp đo phổ NMR, HSQC và chứng minh đƣợc rằng fucoidan thu nhận từ rong
Sargassum aquifolium là một polysaccharide sulfate có cấu trúc vơ cùng phức
tạp. Thành phần mạch chính đƣợc bắt đầu với fuco(xylo)glucuronomannan, xylo(fuco)glucuronan và fucogalactan, mức độ phân nhánh cao và bất thƣờng. Trong thành phần cấu trúc có chƣa các gốc đƣờng mannose, galactose, fucopyranose, xylose, fucofuranose, glucoronic axit và một số lƣợng lớn nhóm sunfate đính tại các vị trí khác nhau.
Kết luận:
Tổng quan cho thấy, Việt Nam mặc dù có nguồn tài ngun rong nâu vơ cùng đa dạng và phong phú [9,10,11,14]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu Việt Nam mới chỉ bắt đầu từ hơn một thập kỉ nay và số các công bố về thành phần, cấu trúc của fucoidan phân lập từ các lồi rong nâu Việt Nam vẫn cịn rất hạn chế. Do vậy, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu tinh
chế và phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Sargassum
oligocystum” là cần thiết nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về fucoidan từ
rong nâu Việt Nam theo hƣớng phát triển các hoạt chất mới cũng nhƣ khả năng ứng dụng hiệu quả của fucoidan trong lĩnh vực y dƣợc.
CHƢƠNG 2.NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Việc nghiên cứu thành phần hóa học và cấu trúc của fucoidan có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm kiếm nguồn dƣợc liệu mới từ tài nguyên rong biển, từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng một cách hợp lý nguồn tài nguyên rong biển ở Nha Trang nói riêng và ở khu vực Nam Trung Bộ của Việt Nam nói chung. Vì vậy, trong khn khổ thực hiện đề tài, tơi tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và các cấu trúc đặc trƣng của fucoidan đƣợc chiết tách từ rong nâu.
Dựa vào danh mục thành phần loài và trữ lƣợng các loài rong nâu phân bố ở Việt Nam đã cơng bố [9,10,11], cùng với tình hình nghiên cứu thực tế về các lồi rong nâu, tơi đã chọn loài rong Sargassum oligocystum để nghiên cứu. Đây là một trong những lồi rong phổ biến, có trữ lƣợng lớn, có giá trị kinh tế cao và có thể khai thác ở quy mô công nghiệp ở vùng biển vịnh Nha Trang tỉnh Khánh Hòa nhƣng lại chƣa đƣợc tác giả nào nghiên cứu . Mẫu rong nâu Sargassum oligocystum đƣợc thu ngay sau thời kỳ sinh sản tại các vùng ven biển tỉnh Khánh Hòa. Thời gian thu hoạch tùy thuộc vào từng lồi rong nhƣng thơng thƣờng vào khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 hàng năm. Các mẫu rong đƣợc thu thập và phân loại bởi PGS.TS. Nguyễn Hữu Đại (chuyên gia phân loài rong biển thuộc Viện Hải Dƣơng học Nha Trang). Khi thu, dùng liềm cắt sát gốc cây rong, rửa sạch khỏi tạp chất bằng nƣớc biển và phơi khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Khối lƣợng mỗi mẫu thu tối thiểu là 10kg rong tƣơi. Các mẫu rong dạng tiêu bản ép khô đƣợc lƣu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang.
*Mô tả thực vật học của rong nâu Sargassum oligocystum (Hình 2.1)
Sargassum oligocystum thuộc ngành rong nâu đƣợc phân loại:
- Ngành: Ochrophyta
- Lớp: Phaeophyceae
- Họ: Sargassaceae
- Chi: Sargassum
- Loài: Sargassum oligocystum
Rong nâu Sargassum oligocystum có tản hình sợi, chiều dài trung bình của rong trƣởng thành khoảng từ 40cm đến 70cm. Phiến lá dạng mỏng có hình bầu dục kéo dài hay mũi giáo, lá dài và dai, chắc, dài khoảng 2-5.5cm, mép lá có hình răng cƣa nhọn, cuống lá hơi ngắn. Phao (túi khí) có hình cầu, hình elip hay hình trái xoan có lơng gai xung quanh, có đƣờng kính 3-4mm. Đĩa bám xẻ thùy khơng sâu có trục chính ngắn từ 0.5cm. Nhánh rong hình trụ to từ 0,3-0,7cm, khoảng cách giữa các nhánh 2-3cm, dài 4-10cm [8,10].