* Chiết tách fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum trong dung môi HCl 0,01N
Các mẫu rong đƣợc cắt nhỏ (2-3 cm), xử lý loại màu và các phân đoạn trọng lƣợng phân tử thấp với hỗn hợp (96% EtOH : Cloroform : H2O = 89 : 1 :10) theo tỉ lệ w/v= 1/10 trong thời gian 10-15 ngày, hỗn hợp đƣợc lọc tách, rong đƣợc phơi khô trong không khí ở nhiệt độ phòng.
Mẫu rong sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu (500 g) đƣợc tiến hành chiết 3 lần với 15 lít dung dịch HCl 0,01N (pH 2-3) ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 2h với mỗi lần chiết. Dịch chiết đƣợc lọc tách thô qua vải lọc, dịch chiết chứa các polysaccharide tan trong nƣớc của 3 lần chiết đƣợc gộp lại và trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 8% đến pH = 6-7. Dịch chiết sau trung hòa đƣợc loại bớt nƣớc bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 50-60oC. Sau đó, chúng tôi lại tiến hành cô đặc và làm sạch dịch chiết bằng màng thẩm tách kích thƣớc 10kDa để thẩm tách loại muối, các hợp chất màu và các tạp chất trọng lƣợng phân tử thấp trong thời gian kéo dài (48 giờ). Dịch chiết sau khi đƣợc làm sạch và cô đặc tới 1/10 thể tích ban đầu và đƣợc kết tủa bằng EtOH 98% theo tỉ lệ thể tích Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đông khô bằng cách sử dụng máy đông khô chân không ta thu đƣợc bột polysaccharide dạng thô chứa fucoidan.
* Chiết tách fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum trong dung môi CaCl2 2%
Chiết tách fucoidan trong dung môi CaCl2 2% thực hiện dựa trên nền tảng phƣơng pháp của Bilan và cộng sự. Rong nâu Sargassum oligocystum đƣợc xử lý ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp Me-OH – CHCl3 – H2O theo tỉ lệ 4:2:1 để loại bỏ các chất màu, lọc rửa với aceton, sấy khô. Sau khi sấy khô rong nâu đƣợc chiết với dung môi CaCl2 2% ở 85oC trong 3 giờ (chiết lặp lại
3 lần). Dịch chiết đƣợc gộp lại, sau đó đem cô quay chân không đến còn 1/4 thể tích ban đầu. Dịch sau cô quay sẽ thêm từ từ hexadecyltrimethylammo- niumbrommide nồng độ 10% trong nƣớc vào để kết tủa polysaccharide sulfate (fucoidan). Kết tủa tạo thành đƣợc ly tâm, rửa với nƣớc cất nhiều lần để loại bỏ cetavlon dƣ. Kết tủa sau đó đƣợc hòa tan bằng cách khuấy trộn với dung môi NaCl bão hòa trong cồn 20% ở nhiệt độ phòng trong vòng 2-3 ngày, khi kết tủa đƣợc hòa tan hết bổ sung thêm 3 lần thể tích cồn 98% để kết tủa fucoidan. Rửa kết tủa với cồn 75% vài lần và sau đó hòa tan lại trong nƣớc cất. Dung môi đƣợc thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô thu đƣợc fucoidan (polysaccharide sulfate) thô dƣới dạng muối Natri.
* Chiết tách fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum trong dung môi n ớc
Quy trình chiết fucoidan bằng nƣớc đƣợc thực hiện dựa trên nền tảng của Percival và Ross từ rong Fucus vesiculosus năm 1950 [22]. Chiết với nƣớc sôi trong 24 giờ. Sau đó loại bỏ alginate và protein bằng Pb-acetate. Fucoidan đƣợc kết tủa bằng Ba(OH)2, tủa dƣới dạng tạo phức với hydroxide, sau đó đem phức đi thủy phân trong H2SO4 loãng. Cuối cùng fucoidan đƣợc tách ra là làm sạch bằng màn thẩm tách trong thời gian kéo dài.
*Phân oạn tinh chế fucoidan bằng sắc ký trao ổi anion
Cân 0,5g bột polysaccharide thô gồm (fucoidan, laminaran và polyuronan) hòa tan trong dung dịch HCl 0,04N, ly tâm tách phần tủa không tan ta loại đƣợc polyuronan (PA) dƣới dạng kết tủa axít polyuronic, phần dịch trong đƣa lên cột DEAE-Cellulose (dạng Cl-, 3,0 x 32 cm). Đầu tiên rửa cột với dung dịch HCl 0,04N đến khi thử âm tính với hydrate cacbon bằng phƣơng pháp phenol-axít sulfuric ta thu đƣợc phân đoạn laminaran, tiếp theo rửa giải cột bằng muối NaCl theo gradient tuyến tính liên tục nồng độ tăng dần từ 0-2N, các phân đoạn fucoidan (F1, F2, F3, F4, F5) đƣợc tách ra theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl, mỗi phân đoạn thu
đƣợc cho thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thƣớc 10kDa trong nƣớc cất sau thời gian 24h, sau đó đem đông khô để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột [83].