400 và 800mg/kg
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục đích chính của đề tài là đánh giá được thành phần hóa học, hoạt tính sinh học, tính an toàn về vi sinh, độc tính cấp và tác dụng chăm sóc sức khỏe của sản phẩm Cao Khai sản xuất từ dây Khai (Coptosapelta flavescens Korth.), bao gồm:
- Xác định được sơ bộ thành phần hóa học, các hoạt chất chính (saponin tổng, polyphenol tổng, flavonoid tổng và anthranoid toàn phần).
- Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa (khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS).
- Đánh giá tính an toàn sinh học (vi sinh vật và kim loại nặng).
- Đánh giá độc tính cấp và tác dụng chăm sóc sức khỏe bằng mô hình kháng viêm và giảm đau.
Địa điểm, thời gian
Nghiên cứu được thực hiện tại các phòng thí nghiệm thuộc:
- Viện Khoa học Môi trường – Trường Đại học Nguyễn Tất Thành. - Khoa Dược – Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
- Khoa Khoa học Tự nhiên – Trường Đại học Cần Thơ - Công ty TNHH phân tích kiểm nghiệm Việt Tín
Thời gian thực hiện: từ tháng 09/2020 đến tháng 03/2021 2.2. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT
a) Nguyên liệu
Cao khô dùng để nghiên cứu là sản phẩm Cao Khai được sản xuất trực tiếp tại xưởng từ nguyên liệu Dây Khai (Coptosapeltaflavescens Korth.) được thu thập vào tháng 09 năm 2020 tại huyện Ninh Sơn, tỉnh Ninh Thuận. Dây Khai (d = 40 mm) sau khi được khai thác từ rừng địa phương sẽ được xử lý sơ bộ, bỏ lá thừa. Sau đó, cắt nhỏ thành từng đoạn (d = 50 mm) để tiến hành quá
trình nấu cao. Dây Khai được nấu 03 lần với nước sôi (khoảng 100oC trong 48 tiếng/1 lần). Kế đến, gộp dung dịch chiết xuất ở 03 lần nấu lại rồi tiến hành cô cao đến khi có độ sánh đặc phù hợp (theo kinh nghiệm thực hiện). Cuối cùng đổ dịch sau cô vào khuôn rồi để khô hoàn toàn trong 24 giờ. Cao Khai thành phẩm lưu hành trên thị trường dưới dạng từng bánh cao khô có khối lựợng từ 0,5 - 1kg, được gói bằng một lớp nilong bọc ngoài. Cao màu nâu đen, có mùi thơm, vị hơi đắng.
Nguyên liệu cao sau khi chuyển về phòng thí nghiệm được làm khô trong tủ sấy ở 60oC cho đến khi độ ẩm đạt dưới 10%, sau đó được xay nhỏ và sàng qua rây mắt lưới (d = 0,5mm) để thu nhận mẫu có kích thước đồng nhất. Mẫu này được bao gói hút chân không và bảo quản ở - 20oC trước khi tiến hành các bước tiếp theo.
Dây khai (Coptosapeltaflavescens Korth.)
Hình 2.2. Quá trình sản xuất Cao Khai
b) Hóa chất
2,2′-azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulfonate, ABTS (Merck); 2,2 – Diphenyl –1–picrylhydrazyl, DPPH, (Merck); Quercetin; Acid gallic (Merck); Vitamin C (acid ascorbic); Aluminium chloride (AlCl3); Potassium acetate (CH3COOK); Folin ciocalteu (Merck), Natri clorid 0,9%, Acid acetic băng 100% khan, Morphin, Diclofenac và các hóa chất khác.
c) Thiết bị
Máy đo pH, Máy đo độ ẩm Ohaus MB90, máy ly tâm Hermile Z200A, bếp lưới gia nhiệt, tủ sấy, Cân phân tích, Đồng hồ bấm giây Q&Q HS, Máy vortex Lab dancer IKA và các thiết bị khác.
d) Dụng cụ
Dụng cụ thủy tinh thông thường (bercher, erlen, đũa thủy tinh, bình định mức, đĩa petri, pipet, micropiet), kim tiêm 1 ml, kim cho chuột uống thuốc đầu tù, falcon 15 và 50 ml, bocal, chén sứ, bocal nhựa, bocal thủy tinh...
2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.3.1. Đánh giá các chỉ tiêu cơ bản
- Độ ẩm nguyên liệu: Sử dụng cân xác định độ ẩm Ohaus MB90 (Mỹ) - Độ tro toàn phần (Theo tiêu chuẩn DĐVN V, phụ lục 9.8 (trang PL- 204): Lấy một chén sứ hoặc chén platin nung tới đỏ trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nếu trong chuyên luận riêng không có hướng dẫn gì
khác thỉ lấy 1 g mẫu thử rải đều vào chén nung, sấy l giờ ở 100°C đến 105°C rồi đem nung trong lò nung ở 600°C ± 25°C. Sau mỗi lần nung, lấy chén nung cùng cắn tro đem làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Trong quá trình thao tác không được để tạo thành ngọn lửa. Nếu sau khi đã nung lâu mà vẫn chưa loại hết carbon của tro thì dùng nước nóng để lấy cắn ra, lọc qua giấy lọc không tro rồi lại nung cắn và giấy lọc trong chén nung. Tập trung dịch lọc vào tro ở trong chén, làm bốc hơi cẩn thận tới khô rồi nung đến khối lượng không đổi.
- Độ tro không tan trong acid HCl (Theo tiêu chuẩn DĐVN V, phụ lục 9.7 (trang PL-203): Cho 25 ml dung dịch acid hydrocỉoric 2 M (TT) vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lọc đổ tập trung những chất không tan vào một phễu thủy tinh xốp đã cân bì, hoặc vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500°C đến khối lượng không đồi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đã làm khô trong không khí.
2.3.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Nguyên tắc là nhằm chiết tách hỗn hợp các chất có trong nguyên liệu thành 3 phân đoạn theo độ phân cực tăng dần (kém phân cực, phân cực trung bình, phân cực mạnh) với các dung môi diethyl ether, ethanol, nước; và xác định các nhóm hợp chất trong dung dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng.
Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo phương pháp của Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2016) được cải tiến và sửa đổi từ quy trình phân tích của I. Ciuley (Đại học Dược Bucharest, Rumani). Quy trình chiết dịch phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật được thực hiện theo Hình 2.2.
Hình 2.1. Quy trình chiết dịch phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật Cao dược liệu sẽ được hòa với dung môi tương ứng với tỉ lệ là 1:20 (g/ml) và tiến hành các phản ứng xác định thành phần hóa học.
Dịch diethyl ether được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: alkaloid, anthraquinon, carotenoid, chất béo, coumarin, flavonoid, tinh dầu, triterpenoid (Hình 2.3).
Hình 2.2. Xác định các chất tan trong dịch chiết diethyl ether Dịch cồn được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: alkaloid, coumarin, flavonoid pyron, flavonoid proanthocyanidin, flavonoid anthocyanin, glycoside tim, tanin, saponin, hợp chất khử, acid hữu cơ (Hình 2.4).
Hình 2.3. Xác định các chất tan trong dịch chiết cồn
Dịch nước được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: acid hữu cơ, alkaloid, glycosid tim, flavonoid pyron, flavonoid proanthocyanidin, flavonoid anthocyanin, hợp chất khử, polyphenol, polyuronic, saponin và tannin (Hình 2.5).
Hình 2.4. Xác định các chất tan trong dịch chiết nước
2.3.3. Đánh giá hàm lượng một số hoạt chất chính Hàm lượng saponin tổng
Cân chính xác khoảng 5g cao, hòa tan trong khoảng 100ml nước cất. Lọc qua giấy lọc. Lắc loại tạp với ether dầu hỏa. Dịch chiết thu được lắc nhiều lần với n-BuOH đến kiệt saponin. Gộp các dịch chiết n-BuOH, đem cất thu hồi dung môi. Cắn chứa saponin toàn phần hòa tan vào lượng nhỏ EtOH 80%, sau
thấy xuất hiện tủa. Lọc lấy tủa, dịch lọc tiếp tục thêm aceton để kết tủa hết saponin. Lọc lấy tủa, sấy đến khối lượng không đổi ở 80°C, cân và tính kết quả.
Hàm lượng saponin toàn phần (X %) được tính theo công thức sau:
𝑋 (%) = 𝑎 × 100
𝑚 × (100 − 𝑑)× 100
Trong đó:
a: khối lượng cắn saponin thu được (g) d: độ ẩm của cao (%)
m: khối lượng dược liệu đã dùng
Hàm lượng polyphenol tổng
Tiến hành pha loãng dung dịch với nồng độ phù hợp (dịch thu được ở phần chiết mẫu). Sau đó, hút 0,5ml dung dịch mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm. Thêm vào 2,5ml dung dịch Folin-Ciocalteu 10% và đồng nhất bằng máy Vortex, để dung dịch phản ứng trong 5 phút. Tiếp tục, thêm 2,0ml dung dịch Na2CO3 7,5% và lắc đều. Để dung dịch ở nhiệt độ phòng trong bóng tối 1 giờ. Sau đó đo độ hấp thu quang học ở bước sóng 765nm trên máy quang phổ UV-Vis. Gallic acid được dùng làm chất chuẩn. Hàm lượng polyphenol được biểu diễn theo microgam đương lượng acid gallic trong 1 mg cao chiết (µgGAE/mg cao chiết) [45].
Hàm lượng flavonoid tổng
Tiến hành pha loãng dung dịch với nồng độ phù hợp (dịch thu được ở phần chiết mẫu). Hút 0,5ml dung dịch mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm, sau đó thêm vào 0,1 ml dung dịch AlCl3 10%. Tiếp tục thêm vào 0,1 ml dung dịch CH3COOK 1M và 4,3ml nước cất, lắc đều. Để dung dịch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó đo độ hấp thu quang học ở bước sóng 415nm trên máy quang phổ UV-Vis. Quercetin được dùng làm chất chuẩn. Hàm lượng flavonoid tổng được biểu diễn theo microgam đương lượng quercetin trong 1 mg cao chiết (µgQE/mg cao chiết).
Hàm lượng triterpensaponin:
Xây dựng đường chuẩn của axit oleanolic:
Dung dịch axit oleanolic pha với nồng độ 2,5 mg/ml, được cho vào các ống nghiệm với các thể tích khác nhau, sau đó 0,2 ml vanillin-axit acetic (5%), 1,2 ml axit percholoric (HClO4), đun cách thủy và ủ ở 70oC trong 15 phút. Các ống được lấy ra và làm mát dưới vòi nước trong 2 phút, sau đó, ethyl acetate được thêm vào sao cho tổng thể tích là 5 ml. Đo độ hấp thu ở bước sóng 550 nm.
Xác định hàm lượng triterpensaponin trong mẫu:
Mẫu sau khi trích ly được lọc, hút chính xác 0,2 ml dịch trích sau ly tâm cho vào ống nghiệm, tiến hành các thao tác như trên. Hàm lượng triterpensaponin được phân tích dựa trên phương pháp quang phổ so màu, đo độ hấp thu quang học ở bước sóng 550 nm.
Hàm lượng triterpensaponin % (g/g chất khô) được tính tính theo công thức sau:
Trong đó:
Cx là nồng độ triterpensaponin (mg/ml); m là khối lượng mẫu (g);
h là độ ẩm nguyên liệu (%); V là thể tích dịch sau ly tâm (ml).
Hiệu suất trích ly saponin triterpenoid trong dịch trích được tính theo công thức:
Hiệu suất trích ly (%) = Hàm lượng triterpensaponin trong dịch
Hàm lượng anthranoid toàn phần
Cân chính xác 2g cao thuốc, đun cách thủy trong bình có ống sinh hàn hồi lưu trong 2 giờ rưỡi với 200 ml CHCl3 và 50 ml H2SO4 25%. Sau đó lắc các dịch chiết CHCl3 với 50 ml dung dịch natri bisulfit 10% trong 5 phút. Sau khi để yên tách lớp CHCl3, lọc và lắc với dung dịch acid hydrochloric 1% trong 5 phút. Sau khi 2 lớp phân cách rõ ràng, tách lớp dưới, lọc và bốc hơi CHCl3, sấy, lúc đầu 60oC rồi sau đó 80oC đến khi khối lượng không đổi [46].
Hàm lượng anthraquinon toàn phần (X %) được tính theo công thức sau:
𝑋 (%) = 𝑎 × 100
𝑚 × (100 − 𝑑)× 100
Trong đó:
a: khối lượng cắn anthraquinon thu được (g) d: độ ẩm của cao (%)
m: khối lượng dược liệu đã dùng
2.3.4. Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa
Phương pháp khử gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
Pha loãng mẫu cao đến khoảng nồng độ phù hợp, hút 0,5ml cao chiết mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm. Mẫu đối chứng thay cao chiết ethanol (99,5%). Sau đó, hút thêm vào ống nghiệm 1,5ml dung dịch DPPH (OD517 nm = 1,1 ± 0,02) vào ống nghiệm và để trong bóng tối trong 30 phút. Đo độ hấp thụ quang học ở 517nm trên máy quang phổ UV-Vis. Vitamin C (acid ascorbic) được sử dụng làm chất chuẩn để so sánh.
Hoạt tính khử gốc tự do DPPH (IC %) được xác định dựa theo công thức:
IC (%) =AbsC − AbsT
AbsC × 100
Trong đó:
AbsT: Độ hấp thụ quang của mẫu thử
Kết quả được ghi nhận dựa trên giá trị IC50, là nồng độ mà tại đó mẫu thử khử được 50% gốc tự do DPPH.
Phương pháp khử gốc tự do ABTS (2,2'-azino-bis)
Dung dịch gốc tự do ABTS● được chuẩn bị bằng cách cho 10ml dung dịch ABTS nồng độ 7,4 mM vào 10ml dung dịch K2S2O8 nồng độ 2,6 mM rồi ủ trong bóng tối trong 24 h, sau đó pha loãng bằng ethanol rồi điều chỉnh độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734 nm đến 1,1 ± 0,02. Pha loãng cao chiết mẫu đến khoảng nồng độ phù hợp, hút 0,5ml cao chiết mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm. Mẫu đối chứng thay cao chiết ethanol (99,5%). Sau đó, hút thêm vào ống nghiệm 1,5ml dung dịch ABTS (OD517 nm = 1,1 ± 0,02) vào ống nghiệm và để trong bóng tối trong 30 phút. Đo độ hấp thụ quang học ở 734nm trên máy quang phổ UV-Vis. Vitamin C (acid ascorbic) được sử dụng làm chất chuẩn để so sánh.
Hoạt tính khử gốc tự do ABTS (IC %) được xác định dựa theo công thức:
IC (%) =AbsC − AbsT
AbsC × 100
Trong đó:
AbsC: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng AbsT: Độ hấp thụ quang của mẫu thử
Kết quả được ghi nhận dựa trên giá trị IC50, là nồng độ mà tại đó mẫu thử khử được 50% gốc tự do ABTS.
2.3.5. Đánh giá xác định tính an toàn về hàm lượng kim loại nặng và vi sinh vật của cao Khai
a. Hàm lượng kim loại nặng có trong mẫu cao Khai được phân tích và đánh giá theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVNII:2012, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc.
Phương pháp thử giới hạn nhiễm khuẩn: Theo tiêu chuẩn DĐVN V, phụ lục 13.6 (trang PL-300). Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong thuốc. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Tiến hành chuẩn bị mẫu, nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, đếm tổng số vi sinh vật, vi nấm sau thời gian nhất định.
2.3.6. Đánh giá độc tính của sản phẩm cao Khai
2.3.6.1. Khảo sát độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng
Nguyên tắc: Nghiên cứu độc tính cấp của mẫu thử trên động vật thí nghiệm, chủ yếu là xác định liều chết trung bình nếu có (liều làm chết 50% số con vật thí nghiệm = LD50, lethal dose 50%) trong những điều kiện nhất định. Biết LD50 mới xác định được chỉ số điều trị TI là một thông số rất quan trọng để quyết định liều điều trị, thường là khoảng 1/10 LD50 hoặc nhỏ hơn [30].
Thực hiện:
Mẫu thử: Cao chiết từ bài thuốc gia truyền cao khai sản xuất tại Ninh Thuận.
Đối tượng: Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino, 6-8 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 22 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện vaccin và sinh phẩm y tế Nha Trang.
Tiến hành: Thí nghiệm khảo sát độc tính cấp của cao chiết được tiến hành theo phương pháp của Kandimalla et al. (2016) có hiệu chỉnh [47]. Cho chuột nhịn đói ít nhất 12 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 2 lô, mỗi lô gồm 6 chuột. Thí nghiệm được bố trí như sau:
Lô 1: Chuột bình thường uống nước cất (đối chứng sinh lý)
Lô 2: Chuột bình thường uống cao khai liều 5000 mg/kg trọng lượng chuột.
Chuột uống nước cất/ cao khai với thể tích tối đa 50 ml/kg trọng lượng chuột theo “Hướng dẫn thử nghiệm phi lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y,
thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27 tháng 10 năm 2015 [30].
Theo dõi và ghi nhận cử động tổng quát, biểu hiện về hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tỷ lệ tử vong của chuột trong vòng 14 ngày [30]. Sau 14 ngày, tất cả chuột thử nghiệm được gây mê bằng CO2, lấy máu tim để xét nghiệm công thức máu và một số chỉ số sinh hóa.
Chỉ tiêu phân tích: Tỉ lệ chuột chết, trọng lượng chuột, sinh hóa như urê, creatinin, AST (SGOT), ALT (SGPT), công thức máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu).
2.3.6.2. Khảo sát độc tính bán trường diễn trên đường uống của chuột nhắt trắng nhắt trắng
Thí nghiệm khảo sát độc tính bán trường diễn của cao chiết được tiến hành theo phương pháp của Kandimalla et al. (2016) có hiệu chỉnh [47].
Các cao chiết được thử nghiệm ở liều 400 mg/kg khối lượng chuột liện tục trong 90 ngày. Sau đó, chuột được rút máu ở tim để xét nghiệm công thức máu và một số chỉ tiêu sinh hóa. Chuột khỏe mạnh sau khi cân trọng lượng được chọn ngẫu nhiên và chia thành 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 6 con chuột. Các nghiệm thức được bố trí như sau:
Nghiệm thức 1: Chuột bình thường uống nước cất (đối chứng sinh lý). Nghiệm thức 2: Chuột bình thường uống cao chiết liều 400 mg/kg pha trong DMSO 1%.
Chỉ tiêu phân tích: Tỉ lệ chuột chết, trọng lượng chuột, sinh hóa như urê, creatinin, AST (SGOT), ALT (SGPT), công thức máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu).
2.3.7. Khảo sát tác động kháng viêm cấp trên mô hình gây viêm bàn chân chuột bằng carrageenan
và β-(1,4)-3,6-hydroD-galactose. Do là hợp chất cao phân tử nên khi vào trong