400 và 800mg/kg
2.4. Xử lý kết quả và phân tích thống kê
Kết quả được xử lý thống kê bằng chương trình Statghraphics Centurions 18.1.12 và Microsoft Excel 365. Phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD được sử dụng để kết luận về sự sai khác giữa nghiệm thức. Kết quả được trình bày ở dạng giá tri ̣trung bình ± SEM (standard error of mean - sai số chuẩn của số trung bình).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA LÝ CỦA CAO KHAI
3.1.1. Kết quả khảo sát vi học bột Cao Khai
Đặc điểm bột cao: Bột màu nâu đen, có mùi thơm đặc trưng của cao, vị đắng, hơi chát.
Soi bột cao trên kính hiển vi tìm thấy rất nhiều tinh thể có hình dạng và kích thước khác nhau. Nhận thấy trong Cao Khai chứa nhiều tinh thể cấu trúc tương tự nhau nhưng khác kích thước, có thể do trong quá trình nấu Cao Khai dùng nhiệt độ cao và khuấy trộn nhiều, nên các tinh thể lớn hơn bị vỡ ra tạo nhiều mảnh nhỏ hơn. Không còn nhận thấy sự hiện diện của các cấu tử có trong bột dược liệu, chứng tỏ cao chiết đã được xử lý tốt trong quá trình chế biến.
Hình 3.1. Hình ảnh vi học của bột cao dây Khai
3.1.2. Xác định độ ẩm
Cao Khai được nghiền nhuyễn và rây rây qua rây 0,5mm để thu được bột Cao Khai có kích thước đồng nhất.
Hình 3.2. Cao Khai và bột Cao Khai
Sau đó, bột Cao Khai được tiến hành xác định độ ẩm theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 12.16.
Bảng 3.1. Độ ẩm bột Cao Khai
STT Khối lượng mẫu (g) Độ ẩm (%)
1 2,0018 10,70
2 2,0010 10,00
3 2,0013 10,60
Trung bình 2,0014 10,43 ± 0,38
Kết quả cho thấy độ ẩm của Cao Khai khá thấp (10,43 %), thích hợp cho việc bảo quản, tuy nhiên cao Khai chưa đạt tiêu chuẩn độ ẩm của cao khô (<5%) mà chỉ đạt tiêu chuẩn của cao đặc (< 20%).
3.1.3. Xác định độ tro toàn phần
Bột Cao Khai được tiến hành xác định độ tro toàn phần theo theo tiêu chuẩn DĐVN 5, phụ lục 9.8, (Tr. PL-204)
Bảng 3.2. Độ tro toàn phần của bột Cao Khai
STT Khối lượng mẫu (g) Độ tro (%)
1 1,0044 9,33
2 1,0019 10,01
3 1,0003 8,72
Trung bình 1,0022 9,35 ± 0,64
3.1.4. Xác định độ tro không tan trong acid
Bột Cao Khai được tiến hành xác định độ không tan theo theo tiêu chuẩn DĐVN 5, phụ lục 9.7, (Tr. PL-203)
Bảng 3.3. Độ tro không tan trong acid của bột Cao Khai
STT Khối lượng mẫu (g) Độ tro (%)
1 1,0044 0,51
2 1,0019 0,47
3 1,0003 0,55
Trung bình 1,0022 0,51 ± 0,04
Kết quả cho thấy độ tro toàn phần của mẫu bột Cao Khai là 0,51 % chứng tỏ dược liệu đã được xử lý kỹ càng trước và sau khi sấy, đảm bảo chất lượng của dược liệu.
3.1.4. Kết quả sơ bộ thành phần hóa thực vật của Cao Khai
Bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, đã xác định được một số nhóm hợp chất có mặt trong Cao Khai (bảng 3.2).
Bảng 3.4. Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trong Cao Khai
Nhóm hợp chất
Phân đoạn Diethyl ete Phân đoạn Ethanol Phân đoạn nước Kết luận
Acid hữu cơ // + +/- +
Alkaloid - - - - Anthraquinon + + + + Carotenoid - // // +/- Chất béo - // // +/- Coumarin + + // + Flavonoid - +/- - +/- Glycosid tim + + + + Hợp chất khử // + + + Polyphenol // + + + Polyuronid // // + + Saponin // + + + Tannin // - - - Tinh dầu + // // + Triterpenoid + + + +
Hình 3.3. Các phản ứng xác định thành phần hóa thực vật định tính: Anthraquinon (a), saponin (b), glycosid tim (c), triterpenoid (d), flavonoid
(e), chất khử (f)
Kết quả phân tích sơ bộ cho thấy trong Cao Khai cũng chứa đa dạng các nhóm hợp chất tự nhiên, trong đó bao gồm: Acid hữu cơ, anthraquinon, coumarin, flavonoid, hợp chất khử, polyuronid, saponin, tinh dầu, triterpenoid và polyphenol. Kết quả này đã thể hiện Cao Khai là một sản phẩm có giá trị cao, qua đó, tiến hành tiếp tục phân tích định lượng một số hợp chất quan trọng trong Cao Khai thông qua những thử nghiệm tiếp theo.
3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ NHÓM HOẠT CHẤT CHÍNH
3.2.1. Hàm lượng saponin tổng
Hàm lượng saponin tổng được xác định bằng phương pháp cân, dựa theo Dược điển Việt Nam IV. Kết quả được nêu trong bảng 3.3.
Bảng 3.5. Hàm lượng saponin tổng của Cao Khai
STT Khối lượng mẫu (g) Khối lượng cắn saponin thu được (g) Độ ẩm mẫu (%) Saponin tổng (%) 1 0,5020 0,0655 10,43 14,57 2 0,5007 0,0742 10,43 16,54 3 0,5034 0,0674 10,43 14,95 Trung bình 15,35 ± 1,05
Kết quả cho thấy, hàm lượng saponin tổng trong Cao Khai đạt giá trị khá cao (15,35 %). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, saponin là nhóm hợp chất mang lại nhiều lợi ích tuyệt vời cho sức khỏe cho con người như: Điều hòa cholesterol trong máu, chống ung thư, giúp sự hoạt động của xương thêm chắc khỏe và kích thích hệ miễn dịch tự nhiên, chống mệt mỏi, bảo vệ gan, giảm stress ... Chính vì vậy, sự có mặt với hàm lượng cao các hợp chất saponin trong “Cao Khai” cũng đã phần nào giải thích một số tác dụng dược lý, cũng như giá trị làm thuốc của loài cây này.
3.2.2. Hàm lượng anthranoid toàn phần
Bảng 3.6. Hàm lượng anthranoid toàn phần của Cao Khai
STT Khối lượng mẫu (g) Khối lượng cắn anthranoid thu được (g) Độ ẩm mẫu (%) Anthranoid toàn phần (%) 1 2,0020 0,665 10,40 0,37 2 2,0008 0,790 10,40 0,44 3 2,0004 0,702 10,40 0,39 Trung bình 0,4 ± 0,03
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng anthranoid toàn phần trong Cao khai ở mức 0,4 ± 0,03 (%). Đã có nhiều báo cáo về công dụng của anthranoid như tác dụng chống loét, chống co thắt, kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy
những tác dụng như hỗ trợ hệ tiêu hóa, nhuận tràng và gây xổ mạnh. Việc sử dụng thuốc có hàm lượng anthranoid cao trong thời gian dài có thể gây ra tiêu chảy, buồn nôn, giảm kali máu thậm chí liệt ruột và sinh ra chất có khả năng gây ung thư ruột. Kết quả đã chứng minh Cao khai có chứa anthranoid và bước đầu có thể minh chứng cho những tác dụng sinh học của sản phẩm khi sử dụng trong thực tế.
3.2.3. Hàm lượng polyphenol, flavonoid và saponin triterpenoid
Hàm lượng polyphenol, flavonoid và saponin triterpenoid được xác định bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis với các chất chuẩn lần lượt là acid gallic, quercetin và acid oleanolic. Kết quả được biểu diễn theo μg đương lượng chất chuẩn tương ứng có trong 1 mg cao khô đem định lượng (Hình 3.4).
Hình 3.4. Hàm lượng polyphenol, flavonoid và saponin triterpenoid có trong Cao Khai
Phenolic là một trong những thành phần quan trọng nhất và chiếm tỉ lệ lớn trong thực vật nói chung. Đây là những chất chống oxi hóa mạnh. Vì vậy, chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của thực vật. Hơn nữa, theo Marja và các đồng sự, những loại thực vật có hàm lượng phenolic tổng lớn hơn 20 µgGAE/mg được xem là có hoạt tính chống oxi hóa mạnh [54]. Kết quả định lượng cho thấy sự có mặt với hàm lượng khá cao của
49,67 5,94 35,79 0 10 20 30 40 50 60 Polyphenol (µgGAE/mg) Flavonoid (µgQE/mg) Saponin triterpenoid (µgOAE/mg) μ g/ m g
nhóm hợp chất polyphenol và flavonoid trong Cao Khai có tiềm năng là một nguồn chất chống oxi hóa tự nhiên dồi dào. Việc đánh giá các hợp chất này dựa trên những tác dụng sinh học của chúng đã được báo cáo và chứng minh trước đó. Ví dụ như hợp chất flavonoid hay các hợp chất polyphenol tổng, bên cạnh những tác dụng sinh học như hỗ trợ tim mạch (nhóm catechin), làm bền thành mạch (nhóm anthocyanidin), bảo vệ gan (thuộc nhóm flavon, flavanon) thì khả năng loại bỏ các gốc tự do của chúng là một tác dụng có giá trị, giúp ngăn ngừa hầu hết các ảnh hưởng có hại cho cơ thể gây ra các loại bệnh tật của con người [55 -56]. Tương tự, các hợp chất saponin cũng đã được chứng minh là có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như tăng khả năng hấp thu của tế bào, kháng khuẩn, kháng viêm,… [57]. Việc lựa chọn những hợp chất này cũng dựa trên những tác dụng của Cao Khai trong thực tế sử dụng mà người dân bản địa truyền tai nhau như: kháng khuẩn, giảm đau, kháng viêm, …
Tuy nhiên, bên cạnh những tác dụng sinh học có lợi thì cũng tồn tại song song những tác dụng không tốt khi sử dụng. Ví dụ như: anthranoid, khi sử dụng ở những liều từ thấp, trung bình đến cao sẽ có lần lượt những tác dụng như hỗ trợ hệ tiêu hóa, nhuận tràng và gây xổ mạnh. Việc sử dụng thuốc có hàm lượng anthranoid cao trong thời gian dài có thể ây ra tiêu chảy, buồn nôn, giảm Kali máu thậm chí liệt ruột và sinh ra chất có khả năng gây ung thư ruột [58-60]. Vì việc đánh giá cụ thể hàm lượng những hợp chất này trong Cao Khai sẽ giúp kiểm soát được liều dùng phù hợp, giúp tăng giá trị sử dụng và giảm tác dụng phụ không mong muốn.
3.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa
Hoạt tính chống oxi hóa của Cao Khai được xác định dựa trên thử nghiệm đánh giá khả năng khử gốc tự do DPPH và ABTS bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 517nm và 734nm trên máy quang phổ UV-Vis. Kết quả được ghi nhận dựa trên giá trị IC50, là nồng độ mà tại đó mẫu thử khử được 50% gốc tự do. Giá trị IC50 càng thấp thì khả năng kháng oxy hóa càng mạnh và ngược lại.
Hình 3.5. Giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do DPPH và ABTS của Cao Khai so với Vitamin C
Kết quả đánh giá cho thấy hoạt tính chống oxi hóa cao nhất là Vitamin C, tiếp đó là Cao Khai cả 2 thử nghiệm DPPH và ABTS. Nhìn chung, Cao Khai có khả năng kháng oxy hóa ở mô hình đánh giá in vitro theo phương pháp bắt gốc tự do DPPH và ABTS. Tuy nhiên, ở phương pháp DPPH, khả năng bắt gốc tự do của Cao Khai thấp hơn vitamin C hơn 26 lần. Điều này có thể giải thích là do bản chất của DPPH là gốc tự do được hòa tan tốt trong các dung môi ít phân cực như ethanol và methanol, nhưng Cao Khai lại được nấu bằng nước, do đó dẫn đến sự hoạt động của các hoạt chất kháng oxy hóa trong Cao Khai bị hạn chế, kéo theo kết quả ở mô hình này thấp hơn so với vitamin C. Trái lại ở phương pháp sử dụng ABTS, gốc tự do ABTS lại không kén dung môi, hơn nữa nó cũng không bị ảnh hưởng bởi pH, do đó có thể sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa cho hầu hết các loại dược liệu. Trong thử nghiệm quét gốc tự do ABTS, Cao Khai cho hoạt tính khá cao với giá trị IC50 là 35,4 μg/ml so với 2,66 μg/ml của Vitamin C (chỉ thấp hơn khoảng 13 lần). Sự khác nhau của kết quả đánh giá khả năng kháng oxy hóa của Cao Khai ở hai phương pháp DPPH và ABTS. Điều này có thể giải thích do trong thực tế, có nhiều loại gốc tự do khác nhau dẫn đến có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính kháng các gốc tự do khác nhau [61]. Bản chất của chất có hiệu quả chống oxy hóa có chứa đa dạng những hợp chất phenolic khác nhau và chúng sẽ có khả năng bắt một
126,06 35,4 4,80 2,66 0 20 40 60 80 100 120 140 DPPH ABTS C ( μ g/ m l)
hoặc một phần các gốc tự do trong mỗi thử nghiệm tùy thuộc vào tính chất của mỗi chất. Cụ thể, những hợp chất phenolic có nhiều nhóm OH tự do, các OH tự do này thường dễ dàng nhường proton H+ cho các chất oxi hóa làm trung hòa các gốc tự do, do đó các cao chiết có chứa càng nhiều các hợp chất phenolic thì hoạt tính chống oxi hóa theo cơ chế quét gốc tự do cần H+ càng cao [62]. Các kết quả trên cho ta thấy tiềm năng to lớn của nguồn nguyên liệu Cao Khai mang lại những tác dụng sinh học quý giá đối với nền y học cổ truyền Việt Nam.
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KIM LOẠI NẶNG, TÍNH AN TOÀN VỀ VI SINH VẬT CỦA CAO KHAI
Bảng 3.7. Kết quả phân tích hàm lượng vi sinh vật và kim loại nặng của Cao Khai
STT/ No. CHỈ TIÊU THỬ NGHIỆM/ PARAMETERS PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH/ TESTING METHOD KẾT QUẢ/ RESULT ĐƠN VỊ TÍNH/ UNIT
1 Enterobacteriaceae (I) ISO 21528 – 2 : 2017
Không phát hiện (LOD=10)
CFU/g
2 Tổng số vi sinh vật hiếu khí (*) (I)
TCVN 4884 – 1: 2015 (ISO 4833 – 1: 2013) 2,0x101 CFU/g 3 E. coli (*) (I) TCVN 7924 – 2 : 2008 (ISO 16649 – 2 : 2001) Không phát hiện (LOD=10) CFU/g
4 S. aureus (I) AOAC 975.55
Không phát hiện (LOD=10) CFU/g 5 Salmonella (I) TCVN 10780 – 1 : 2017 (ISO 6579 – 1 : 2017) Không phát hiện trong 25g 6 Tổng số bào tử nấm men (I) TCVN 8275 – 2 : 2010
(ISO 21527 – 2 : 2008) Không phát hiện (LOD=10) CFU/g 7 Tổng số bào tử nấm mốc (I) TCVN 8275 – 2 : 2010 (ISO 21527 – 2 : 2008) Không phát hiện (LOD=10) CFU/g
8 Pseudomonas aeruginosa (I)
SOP.03-031 TK. TCVN 8881 : 2011 (Ref. ISO 16266 : 2006) Không phát hiện (LOD=10) CFU/g
9 Cadimi (Cd) (*) (I) AOAC 999.11 0,010 mg/kg
10 Chì (Pb) (*) (I) AOAC 999.11
Không phát hiện (LOD=0,01)
mg/kg
11 Thủy ngân (Hg) (*) (I) AOAC 974.14
Không phát hiện (LOD=0,05)
mg/kg
12 Arsen (As) (*) (I) AOAC 986.15
Không phát hiện (LOD=0,05)
mg/kg
Ghi chú/ Notes:
LOD: Giới hạn phát hiện / LOD: Limit of Detection.
(*): Chỉ tiêu được VILAS công nhận ISO/IEC 17025:2017/Items were accredited by VILAS (ISO/IEC 17025:2017).
(I): Chỉ tiêu được chỉ định của Bộ Y Tế/ Items were designated by Ministry of Health.
Kết quả phân tích hàm lượng vi sinh vật và kim loại nặng của Cao Khai được thể hiện ở bảng 3.4. Nhìn chung sản phẩm “Cao Khai” hầu như an toàn với các chỉ số vi sinh và kim loại nặng. Tuy nhiên, trong đó có hai chỉ tiêu xảy ra bất thường đó là: tổng số vi sinh vật hiếu khí và kim loại cadimi. Nguyên nhân của điều này nhiều khả năng là do ảnh hưởng của quá trình sản xuất thô sơ của dân bản địa từ giai đoạn thu hái đến quá trình chiết tách và cô đặc. Có thể, vi sinh và kim loại nặng bị lây nhiễm ở giai đoạn này hoặc trong quá trình đóng gói, vận chuyển. Do đó, cần xem xét và cải thiện quy trình sản xuất Cao Khai của người dân, từ đó kiểm soát các chỉ tiêu vi sinh, kim loại không vượt quá mức cho phép.
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHAI
3.3.1. Độc tính cấp của Cao Khai
Để khẳng định cơ sở khoa học về độ an toàn của Cao Khai đối với chuột thử nghiệm, chế phẩm đã được khảo sát khả năng gây độc tính cấp. Sau 72 giờ uống 1 liều duy nhất Cao Khai với nồng độ 5000 mg/kg trọng lượng chuột (thể tích 50ml/kg trọng lượng), tất cả chuột đều khỏe mạnh, cử động bình thường, không có biểu hiện co giật, tiêu chảy hay xù lông, thở gấp. Khả năng gây độc tính của một chất không chỉ khi gây ra khả năng chết cho động vật mà còn tùy thuộc vào cơ chế dược lý chống lại quá trình sinh học của cơ thể gây ra những tác dụng không mong muốn, có hại cho động vật. Do đó, chuột thí nghiệm đã được cho sử dụng sản phẩm Cao Khai sẽ được quan sát và theo dõi tình trạng hoạt động, khả năng tiêu thụ thức ăn, nước uống, khối lượng cơ thể và biểu hiện về hành vi trong 14 ngày.
Kết quả, chuột ăn uống và di chuyển bình thường trong suốt 14 ngày thử nghiệm. Sau 14 ngày thử nghiệm, chuột được tiến hành cân trọng lượng chuột, lấy máu tim để xác định thông số huyết học và các chỉ số sinh hóa.
Bảng 3.8. Tỷ lệ chuột sống/chết ở các lô thử nghiệm độc tính cấp
Lô thử nghiệm Số chuột thử nghiệm
Số chuột chết
Tỷ lệ chuột chết (%)
Lô 1 (đối chứng sinh lý) 6 0 0
Lô 2 (Cao Khai liều 5000